對大腸桿菌等平臺生物的代謝途徑進行改造,積累有用代謝產(chǎn)物是現(xiàn)代發(fā)酵工程和合成生物學(xué)的核心內(nèi)容。啟動子是基因調(diào)控和代謝途徑改造的重要調(diào)控元件,通過改變啟動子的啟動活性可以調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平以積累代謝產(chǎn)物。本實驗室的前期工作用鳥槍法從小球藻病毒基因組隨機片段中篩選到一組小球藻病毒強啟動子N63,N37,N40;利用RT-qPCR檢測了這些啟動子控制下的報告基因轉(zhuǎn)錄文本豐度,用RACE-PCR確定了轉(zhuǎn)錄起始位點,推測了-10區(qū)和-35區(qū)核心結(jié)構(gòu),并對這些啟動子進行截短等突變。通過PCR等分子生物學(xué)技術(shù)將各突變啟動子連接于啟動子探測質(zhì)粒pKK232-8上,使其可以表達氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat。之后將攜帶各小球藻病毒來源強啟動子重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)于含有450μg/mL的LB培養(yǎng)基中進行生長曲線測定來間接分析上述啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。本研究從大腸桿菌基因組擴增lacZ基因并與經(jīng)密碼子優(yōu)化的egfp基因通過Overlap PCR融合,兩者之間插入氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat的RBS序列,構(gòu)建由已知細菌強啟動子tac或從生長曲線實驗中挑選的小球藻病毒強啟動子控制的人工操縱子,替代啟動子探測質(zhì)粒p... 

【文章來源】：河北大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

大腸桿菌蘇氨酸生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1ThreoninebiosynthesisandmetabolismnetworkofEscherichiacoli

第1章綜述7單，基因編輯效率最為高效，應(yīng)用也最為廣泛。CRISPR系統(tǒng)主要通過crRNA和tracrRNA引導(dǎo)Cas(CRISPR-associatedsystem)蛋白來實現(xiàn)功能[57]。進一步通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將二者連接在一起形成sgRNA(singleguideRNA)，融合后的RNA與野生型RNA具有同樣的功能。sgRNA是CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)中DNA的靶向片段[58]。利用CRISPR-Cas9在基因靶點位置形成DSB缺口，進而激活了細胞DNA的同源重組修復(fù)機制。介導(dǎo)外源DNA靶向編輯[59]�；诖嗽砜梢詫蚪M的特定位點進行基因敲除、基因替換等各種遺傳操作。CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)存著不同程度的脫靶現(xiàn)象[60]。主要是sgRNA選擇不當(dāng)?shù)膯栴}，通過軟件分析脫靶位點可以有效降低sgRNA的脫靶率；CRISPR-Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)還與PAM序列有關(guān)，PAM序列為NGG時的編輯效率最高[61]。圖2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯模式圖Fig.2CRISPR/cas9mediatedgenomeeditingpattern1.9研究意義啟動子是基因表達系統(tǒng)中的重要組成元件，是基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)。因此強啟動子的篩選對于代謝產(chǎn)物的積累意義重大。本研究應(yīng)用多種分子生物學(xué)技術(shù)對小球藻病毒來源強啟動子的啟動活性進行檢測。最終篩選得到多個具有強啟動活性的啟動子用作后續(xù)實驗。通過構(gòu)建lacZ-egfp雙報告基因串聯(lián)表達載體來對篩選得到的小球藻病毒強啟動子進行進一步研究。通過啟動子對雙報告基因的轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平和蛋白質(zhì)水平的比較進而確定活性強弱[64,65]。目前還未發(fā)現(xiàn)將lacZ-egfp雙報告基因應(yīng)用于小球藻病毒強啟動子篩選及以大腸桿菌為載體進行啟動活性檢測的研

第3章突變啟動子的構(gòu)建及生長曲線實驗17第3章突變啟動子的構(gòu)建及生長曲線實驗3.1試驗方法3.1.1突變型啟動子重組質(zhì)粒構(gòu)建3.1.1.1N63突變型啟動子重組質(zhì)粒構(gòu)建利用前期RACEPCR結(jié)果確定啟動子N63的轉(zhuǎn)錄起始位點、-10、-35區(qū)以后，本研究參考tac的保守區(qū)域和特點對啟動子N63進行截短突變以及-10區(qū)和-35區(qū)突變。突變示意圖見圖3，圖中N63WT代表野生型N63啟動子，其他為突變型啟動子。圖3N63啟動子突變示意圖Fig.3DiagramofN63promotermutationN63-2啟動子是在N63野生型啟動子的基礎(chǔ)上進行截短突變獲得的啟動子，在-35區(qū)前只保留了4個堿基；N63-3是在截短突變的N63-2啟動子的基礎(chǔ)上將原本N63啟動子的-10區(qū)和-35替換為tac啟動子的-10區(qū)和-35區(qū)獲得的啟動子；N63-4是在截短突變的N63-2啟動子的基礎(chǔ)上將原本N63啟動子的-10區(qū)替換tac啟動子的-10區(qū)，-35區(qū)維持不變獲得的啟動子；N63-5是在截短突變的N63-2啟動子的基礎(chǔ)上將原本N63啟動子的-35區(qū)替換tac啟動子的-35區(qū)，-10區(qū)維持不變獲得的啟動子。

【參考文獻】：
期刊論文
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