對(duì)大腸桿菌等平臺(tái)生物的代謝途徑進(jìn)行改造,積累有用代謝產(chǎn)物是現(xiàn)代發(fā)酵工程和合成生物學(xué)的核心內(nèi)容。啟動(dòng)子是基因調(diào)控和代謝途徑改造的重要調(diào)控元件,通過(guò)改變啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性可以調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平以積累代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作用鳥(niǎo)槍法從小球藻病毒基因組隨機(jī)片段中篩選到一組小球藻病毒強(qiáng)啟動(dòng)子N63,N37,N40;利用RT-qPCR檢測(cè)了這些啟動(dòng)子控制下的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄文本豐度,用RACE-PCR確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),推測(cè)了-10區(qū)和-35區(qū)核心結(jié)構(gòu),并對(duì)這些啟動(dòng)子進(jìn)行截短等突變。通過(guò)PCR等分子生物學(xué)技術(shù)將各突變啟動(dòng)子連接于啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒pKK232-8上,使其可以表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat。之后將攜帶各小球藻病毒來(lái)源強(qiáng)啟動(dòng)子重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)于含有450μg/mL的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定來(lái)間接分析上述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。本研究從大腸桿菌基因組擴(kuò)增lacZ基因并與經(jīng)密碼子優(yōu)化的egfp基因通過(guò)Overlap PCR融合,兩者之間插入氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat的RBS序列,構(gòu)建由已知細(xì)菌強(qiáng)啟動(dòng)子tac或從生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)中挑選的小球藻病毒強(qiáng)啟動(dòng)子控制的人工操縱子,替代啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒p... 

【文章來(lái)源】：河北大學(xué)河北省

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

大腸桿菌蘇氨酸生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1ThreoninebiosynthesisandmetabolismnetworkofEscherichiacoli

第1章綜述7單，基因編輯效率最為高效，應(yīng)用也最為廣泛。CRISPR系統(tǒng)主要通過(guò)crRNA和tracrRNA引導(dǎo)Cas(CRISPR-associatedsystem)蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)功能[57]。進(jìn)一步通過(guò)基因工程手段對(duì)crRNA和tracrRNA進(jìn)行改造，將二者連接在一起形成sgRNA(singleguideRNA)，融合后的RNA與野生型RNA具有同樣的功能。sgRNA是CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)中DNA的靶向片段[58]。利用CRISPR-Cas9在基因靶點(diǎn)位置形成DSB缺口，進(jìn)而激活了細(xì)胞DNA的同源重組修復(fù)機(jī)制。介導(dǎo)外源DNA靶向編輯[59]�；诖嗽砜梢詫�(duì)基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行基因敲除、基因替換等各種遺傳操作。CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)存著不同程度的脫靶現(xiàn)象[60]。主要是sgRNA選擇不當(dāng)?shù)膯?wèn)題，通過(guò)軟件分析脫靶位點(diǎn)可以有效降低sgRNA的脫靶率；CRISPR-Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)還與PAM序列有關(guān)，PAM序列為NGG時(shí)的編輯效率最高[61]。圖2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯模式圖Fig.2CRISPR/cas9mediatedgenomeeditingpattern1.9研究意義啟動(dòng)子是基因表達(dá)系統(tǒng)中的重要組成元件，是基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)關(guān)。因此強(qiáng)啟動(dòng)子的篩選對(duì)于代謝產(chǎn)物的積累意義重大。本研究應(yīng)用多種分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)小球藻病毒來(lái)源強(qiáng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性進(jìn)行檢測(cè)。最終篩選得到多個(gè)具有強(qiáng)啟動(dòng)活性的啟動(dòng)子用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)構(gòu)建lacZ-egfp雙報(bào)告基因串聯(lián)表達(dá)載體來(lái)對(duì)篩選得到的小球藻病毒強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過(guò)啟動(dòng)子對(duì)雙報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平和蛋白質(zhì)水平的比較進(jìn)而確定活性強(qiáng)弱[64,65]。目前還未發(fā)現(xiàn)將lacZ-egfp雙報(bào)告基因應(yīng)用于小球藻病毒強(qiáng)啟動(dòng)子篩選及以大腸桿菌為載體進(jìn)行啟動(dòng)活性檢測(cè)的研

第3章突變啟動(dòng)子的構(gòu)建及生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)17第3章突變啟動(dòng)子的構(gòu)建及生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)3.1試驗(yàn)方法3.1.1突變型啟動(dòng)子重組質(zhì)粒構(gòu)建3.1.1.1N63突變型啟動(dòng)子重組質(zhì)粒構(gòu)建利用前期RACEPCR結(jié)果確定啟動(dòng)子N63的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、-10、-35區(qū)以后，本研究參考tac的保守區(qū)域和特點(diǎn)對(duì)啟動(dòng)子N63進(jìn)行截短突變以及-10區(qū)和-35區(qū)突變。突變示意圖見(jiàn)圖3，圖中N63WT代表野生型N63啟動(dòng)子，其他為突變型啟動(dòng)子。圖3N63啟動(dòng)子突變示意圖Fig.3DiagramofN63promotermutationN63-2啟動(dòng)子是在N63野生型啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上進(jìn)行截短突變獲得的啟動(dòng)子，在-35區(qū)前只保留了4個(gè)堿基；N63-3是在截短突變的N63-2啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上將原本N63啟動(dòng)子的-10區(qū)和-35替換為tac啟動(dòng)子的-10區(qū)和-35區(qū)獲得的啟動(dòng)子；N63-4是在截短突變的N63-2啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上將原本N63啟動(dòng)子的-10區(qū)替換tac啟動(dòng)子的-10區(qū)，-35區(qū)維持不變獲得的啟動(dòng)子；N63-5是在截短突變的N63-2啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上將原本N63啟動(dòng)子的-35區(qū)替換tac啟動(dòng)子的-35區(qū)，-10區(qū)維持不變獲得的啟動(dòng)子。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]殺鮭氣單胞菌SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 劉帥,盧彤巖,王荻,曹永生,賈鐘賀,王淵博,李紹戊.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2017(07)
[2]釀酒酵母人工雜合啟動(dòng)子與天然啟動(dòng)子活性比較[J]. 唐瑞琪,熊亮,白鳳武,趙心清.  生物技術(shù)通報(bào). 2017(01)
[3]短小芽孢桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選[J]. 賀婷停,宋婷,王超,張長(zhǎng)斌,王海燕.  生物技術(shù)通報(bào). 2016(11)
[4]利用CRISPR/Cas9構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的斑馬魚(yú)WHSC1L1純合突變體[J]. 陳韻如,王湘秀,李紹娟,劉桂芬.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(06)
[5]產(chǎn)甲烷古菌中CRISPR簇的研究[J]. 方靜,侯佳林,張宇,王風(fēng)平,何瑩.  微生物學(xué)通報(bào). 2016(11)
[6]豬β防御素2脅迫下大腸桿菌內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析[J]. 張坤,張恒,于志明,陳銳博,鄭振宇,李春麗.  河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(01)
[7]CRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA設(shè)計(jì)與脫靶效應(yīng)評(píng)估[J]. 謝勝松,張懿,張利生,李廣磊,趙長(zhǎng)志,倪攀,趙書(shū)紅.  遺傳. 2015(11)
[8]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 李聰,曹文廣.  生物工程學(xué)報(bào). 2015(11)
[9]產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及誘變育種[J]. 梁金鐘,李雯,王風(fēng)青.  食品科學(xué). 2013(23)
[10]基于CTC-流式細(xì)胞儀活性細(xì)菌總數(shù)的快速檢測(cè)技術(shù)研究[J]. 林怡雯,楊天,李丹,何苗.  環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào). 2013(09)



本文編號(hào)：3135591