致病桿菌屬（Xenorhabdus sp.）是腸桿菌科一類(lèi)與斯氏線蟲(chóng)屬（Steinernema sp.）互利共生的革蘭氏陰性細(xì)菌,能產(chǎn)生大量具有殺蟲(chóng)、抑菌、抗腫瘤等生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物�；趯�(duì)致病桿菌HN_xs01基因組測(cè)序以及生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)基因組中存在大量的隱性基因簇,而目前對(duì)致病桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究缺乏有效的基因編輯方法,從而阻礙了新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)。Red/ET同源重組技術(shù)通過(guò)短同源臂以及重組酶能夠高效的促進(jìn)雙鏈斷裂修復(fù)和瞬間重組,重組效率高,逐漸成為基因功能探索以及新菌株構(gòu)建的有力手段。本研究旨在以Red/ET同源重組原理為基礎(chǔ),基于致病桿菌全基因組測(cè)序結(jié)果,應(yīng)用致病桿菌自身噬菌體的重組酶在致病桿菌HN_xs01中建立和優(yōu)化新型重組酶系統(tǒng),以便高效快捷地進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的挖掘。主要研究結(jié)果如下:（1）致病桿菌和氣單胞菌重組系統(tǒng)的研究。通過(guò)將致病桿菌和殺鮭氣單胞菌的基因組及噬菌體基因與Red/ET同源重組蛋白進(jìn)行Blast比對(duì),在致病桿菌中獲得了Redα、Redβ的同源蛋白,在氣單胞菌中獲得了RecE、Rec T、Redγ的同源蛋白... 

【文章來(lái)源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

Red/ET重組系統(tǒng)示意圖

碩士學(xué)位論文6證獲得正確的重組子（圖1-2）。直接克隆可以高效準(zhǔn)確的從大腸桿菌，酵母或小鼠胚胎干細(xì)胞中純化的總基因組DNA中獲取目的DNA。直接克隆在挖掘新的天然產(chǎn)物的生物合成基因簇或提高細(xì)菌的化合物產(chǎn)量中有著重要的潛在作用。Bian通過(guò)RecE/RecT介導(dǎo)的LLHR從丁香假單胞菌的基因組DNA直接克隆丁香脂素基因簇，并在大腸桿菌中表達(dá)，由此發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的丁香脂素家族成員[55]。Liu通過(guò)Red/ET重組直接克隆天然產(chǎn)物生物合成基因簇（BGCs）并在枯草芽孢中成功表達(dá)了細(xì)菌霉素的基因簇[56]。迄今為止，已經(jīng)使用該方法克隆了幾種基因簇并進(jìn)行了異源表達(dá)，包括發(fā)光素（luminmycin）[57],丁香脂素（syringolin）[55],格列巴�。╣lidobactin）[58],colibactin[59],sevadicin[60],以及沙利霉素（salinomycin）[61]基因簇。圖1-2直接克隆流程圖[6]Figure1-2Directcloningflowchart[6]（3）亞克�。褐笍募�(xì)菌的染色體或質(zhì)粒上，通過(guò)Red/ET重組技術(shù)，亞克隆特定的DNA片段到合適的載體上。首先構(gòu)建帶有一個(gè)質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）和一個(gè)抗生素選擇標(biāo)記（sm）基因，以及兩側(cè)是兩個(gè)寡核苷酸同源臂的線性克隆載體。接著將克隆載體轉(zhuǎn)入表達(dá)Red/ET同源重組酶的大腸桿菌中，通過(guò)同源配對(duì)，與細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒、染色體或其他片段的特定DNA序列發(fā)生重組，形成穩(wěn)定的環(huán)狀質(zhì)粒以在大腸桿菌中穩(wěn)定復(fù)制（圖1-3）。選擇復(fù)制載體時(shí)，需選擇可容納合適目的片段大小的質(zhì)粒，不能超過(guò)質(zhì)粒復(fù)制子所容納的最大承載量，否則很大可能會(huì)導(dǎo)致重組失敗。亞克隆與直接克隆相似的是，都需要構(gòu)建一個(gè)線性載體克隆目的片段，都可在RecE和RecT重組酶的介導(dǎo)下發(fā)生重組。不同的是，直接克隆是將線性載體和待克隆的目的片段在體外構(gòu)建并同時(shí)轉(zhuǎn)入含有Red/ET重組酶的大腸桿菌中，而亞克隆是只將線

┝爍?玫鬧С幀Ｖ虜「司?男捅渚哂鋅贍嫘裕?雹裥妥?湮??型后，在一定的培養(yǎng)條件下，Ⅱ型可以重新轉(zhuǎn)變?yōu)棰裥蚚74]。這兩種變體在形態(tài)以及生長(zhǎng)特性等方面存在明顯的差異，可以通過(guò)以下幾個(gè)特征來(lái)區(qū)分：（1）菌落形態(tài)，I型變體在營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基上呈現(xiàn)白色不透明、菌落形態(tài)孝濕潤(rùn)，II型變體菌落則是白色半透明、菌落形態(tài)較大、較干燥。（2）吸附染料，Ⅰ型變體可以在瓊脂平板上吸附染料，例如在溴百里酚藍(lán)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NBTA）生長(zhǎng)時(shí)，由于攝取溴百里酚藍(lán)菌落呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)綠色，而在II型變體不能吸附染料而呈現(xiàn)白色（圖1-4A）。（3）產(chǎn)酶能力，Ⅰ型變體可以產(chǎn)生磷脂酶（卵磷脂酶），而II型變體不能產(chǎn)生。（4）運(yùn)動(dòng)性，Ⅰ型變體具有鞭毛，在半固體培養(yǎng)基（0.6至1.2％瓊脂）上生長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)成群運(yùn)動(dòng)，并且能快速的協(xié)調(diào)種群遷移周期，因此更能穩(wěn)定的在線蟲(chóng)中生長(zhǎng)，并幫助線蟲(chóng)更好的適應(yīng)環(huán)境，生長(zhǎng)，繁殖；而II型變體無(wú)法在半固體瓊脂中運(yùn)動(dòng)，同樣在嗜線蟲(chóng)中生長(zhǎng)時(shí)也無(wú)法游動(dòng)（圖1-4B）。（5）抗生素的產(chǎn)生，Ⅰ型變異體可以產(chǎn)生在瓊脂上擴(kuò)散的化學(xué)抗生素，能最大程度地減少其他微生物對(duì)尸體的二次入侵，而II型變體則不產(chǎn)生此類(lèi)化合物。圖1-4致病桿菌變異體形態(tài)差異Figure1-4MorphologicaldifferencesofXenorhabdus（A）致病桿菌Ⅰ型變體在NBTA培養(yǎng)基生長(zhǎng)形態(tài)。（B）半固體瓊脂平板上生長(zhǎng)的嗜線蟲(chóng)致病桿菌變異體的形態(tài)學(xué)觀察[74]；a:I型變體；b：II型變體。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]蘇云金芽胞桿菌高效電轉(zhuǎn)化方法的建立[J]. 李宇晟,張旭,胡曉鳳,丁學(xué)知,夏立秋,胡勝標(biāo).  湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào). 2013(02)
[2]嗜線蟲(chóng)致病桿菌Xna基因同源重組載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 魏明敏,邱德文,曾洪梅,黃建新,楊秀芬,袁京京.  生物技術(shù)通報(bào). 2009(04)

碩士論文
[1]嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001cpxR基因敲除對(duì)其抑菌活性及生長(zhǎng)代謝的影響[D]. 湯倩.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
[2]昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌的分離及其活性和腫瘤靶向性研究[D]. 張超.湖南師范大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3134930