隨著目前霧霾等環(huán)境問題的日益嚴(yán)峻,不管是從能源的安全問題還是從減少空氣污染物排放來看,對可再生資源的研究顯得至關(guān)重要。微藻又以其生長速度快、占地面積小、單位產(chǎn)油量高等諸多優(yōu)點成為生產(chǎn)生物柴油非常有優(yōu)勢的原料,其油脂代謝途徑以及如何增加產(chǎn)油量也成為近年來研究的熱點。本文對萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）油脂代謝途徑中三酰甘油TAG合成的最后一步關(guān)鍵酶二脂酰甘油�；D(zhuǎn)移酶基因CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5的啟動子進(jìn)行研究。首先實驗研究了在缺氮、缺硫和缺磷的逆境條件下,萊茵衣藻的生物量和油脂含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺氮、缺硫、缺磷有利于萊茵衣藻油脂的積累,但是會導(dǎo)致生物量相應(yīng)的減少。同時Real time PCR也發(fā)現(xiàn),CrDGAT1、CrDGAT2-1、 CrDGAT2-5在HSM-P、低溫和HSM-N培養(yǎng)的CC425藻株中mRNA表達(dá)量也較正常HSM培養(yǎng)時高。實驗通過構(gòu)建一系列CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5啟動子片段的缺失載體,轉(zhuǎn)入C. Reinhardtii CC425,檢測報告基因ARS的酶活性。結(jié)果顯示,在... 

【文章來源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 微藻生物質(zhì)能源研究背景
        1.1.1 日益嚴(yán)峻的能源危機(jī)與環(huán)境問題
        1.1.2 生物質(zhì)能與能源微藻
        1.1.3 能源微藻產(chǎn)油的優(yōu)勢與存在的問題
    1.2 微藻油脂積累的特點及影響因素
        1.2.1 微藻產(chǎn)油的過程
        1.2.2 營養(yǎng)元素（Nutrients）對油脂積累的影響
        1.2.3 溫度（Temperature）對微藻油脂積累的影響
    1.3 實驗藻株的選擇
    1.4 實驗基因的選擇
        1.4.1 二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）
        1.4.2 二脂酰甘油�；D(zhuǎn)移酶（DGAT）的生物信息學(xué)分析
    1.5 基因研究采用的關(guān)鍵技術(shù)
        1.5.1 基因克隆技術(shù)
        1.5.2 RealTime-PCR（實時熒光定量PCR）技術(shù)
    1.6 研究目的與意義
    1.7 技術(shù)路線
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料與試劑
        2.1.1 實驗微藻
        2.1.2 實驗儀器
        2.1.3 工程菌株及載體
        2.1.4 實驗用試劑
        2.1.5 實驗主要培養(yǎng)基的配制
        2.1.6 實驗中設(shè)計的引物序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 萊茵衣藻在HSM-N,HSM-P,HSM-S條件下生理生化反應(yīng)
        2.2.2 CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5啟動子全長的克隆
        2.2.3 CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5啟動子刪減片段的克隆
        2.2.4 陽性克隆載體與pArg7.8共轉(zhuǎn)化萊茵衣藻CC425
        2.2.5 轉(zhuǎn)化子啟動子應(yīng)答條件的篩選
        2.2.6 啟動子應(yīng)答區(qū)域逐步突變克隆載體構(gòu)建與順式作用元件的確定
        2.2.7 SYBR-Green Ⅰ熒光定量PCR分析野生藻株以及轉(zhuǎn)化藻株在逆境條件的基因表達(dá)
3 實驗結(jié)果
    3.1 萊茵衣藻CC124和CC425在缺氮、缺硫條件下生理生化指標(biāo)
        3.1.1 藻株在缺氮、缺硫條件下生物量變化
        3.1.2 藻株在缺氮、缺硫條件下油脂含量變化
        3.1.3 藻株在缺氮、缺硫條件下藻狀態(tài)及油滴顯微拍照
    3.2 萊茵衣藻CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5啟動子全長的克隆
        3.2.1 萊茵衣藻CC425總DNA的提取
        3.2.2 CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5啟動子全長片段擴(kuò)增
        3.2.3 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5啟動子全長片段與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選
        3.2.4 測序結(jié)果分析
    3.3 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5啟動子5’和3’端逐步缺失片段的克隆
        3.3.1 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5啟動子缺失片段的擴(kuò)增
        3.3.2 CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5啟動子缺失片段較長片段的克隆
    3.4 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5啟動子長缺失片段轉(zhuǎn)化CC425藻株,確定轉(zhuǎn)化子反應(yīng)的逆境條件
    3.5 CrDGA T2-1啟動子缺失片段克隆載體的構(gòu)建與數(shù)據(jù)分析
        3.5.1 CrDGAT2-1啟動子缺失片段克隆載體的構(gòu)建
        3.5.2 轉(zhuǎn)化子藻株ARS酶活性分析
    3.6 CrDGAT2-1啟動子-319,-247段逐步突變克隆載體構(gòu)建與數(shù)據(jù)分析
        3.6.1 CrDGAT2-1啟動子-319,-247段逐步突變引物設(shè)計
        3.6.2 CrDGAT2-1啟動子-319,-247段逐段突變克隆載體的構(gòu)建
    3.7 SYBR-Green Ⅰ熒光定量PCR檢測CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5 mRNA表達(dá)水平
        3.7.1 在CC425正常,HSM-P,低溫；CC124正常,HSM-N,條件下CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5 mRNA表達(dá)水平
        3.7.2 CrDGAT2-1啟動子在轉(zhuǎn)化藻種的mRNA表達(dá)量
4 討論
    4.1 關(guān)于啟動子反應(yīng)逆境條件的選擇
    4.2 關(guān)于啟動子應(yīng)答反應(yīng)區(qū)域的確定
    4.3 qRT-PCR分析基因的表達(dá)
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3082077