外二醇雙加氧酶是一類(lèi)廣泛存在于自然界中,能夠裂解多種芳烴類(lèi)底物的酶。外二醇雙加氧酶主要依賴(lài)金屬離子來(lái)完成催化,能夠有效除去環(huán)境中累積的有毒鄰苯二酚類(lèi)污染物質(zhì),對(duì)環(huán)境的修復(fù)具有積極意義。同時(shí),外二醇雙加氧酶可應(yīng)用于工業(yè)加工、石油冶煉、生物制藥等多個(gè)與芳香烴密切相關(guān)的領(lǐng)域,并清除其生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的難以降解的芳香烴類(lèi)物質(zhì),該過(guò)程是工業(yè)生產(chǎn)與排污治理的不可或缺的一個(gè)環(huán)節(jié)。雙加氧酶Tc3516的基因來(lái)自高溫單胞菌屬Thermomonospora curvata,通過(guò)連接質(zhì)粒pET-28a構(gòu)建表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌E.coli BL21（DE3）中表達(dá)蛋白。隨后通過(guò)Ni²⁺-NTA親和層析純化目的蛋白,并進(jìn)行性質(zhì)表征。經(jīng)檢測(cè),Tc3516的最適底物為3-甲基鄰苯二酚,最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)緩沖液為50mM、pH為9的Gly-NaOH,在最適反應(yīng)條件下測(cè)得酶的比活力為3.70 U/mg。為特異性提高該酶對(duì)3-甲基鄰苯二酚的催化活力,對(duì)蛋白受體與底物配體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)模擬與分子對(duì)接,并根據(jù)對(duì)接結(jié)果,在酶的活性位點(diǎn)附近根據(jù)“增大氨基酸疏水性,減少氨基酸殘基的空間位阻”原則選... 

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【文章頁(yè)數(shù)】：91 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 雙加氧酶概述
    1.3 外二醇雙加氧酶的分類(lèi)
    1.4 外二醇雙加氧酶的結(jié)構(gòu)
    1.5 外二醇雙加氧酶的催化機(jī)制
    1.6 基因水平上進(jìn)行酶分子的改造
        1.6.1 定向進(jìn)化
        1.6.2 定點(diǎn)突變
    1.7 雙加氧酶的應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.7.1 利用表達(dá)雙加氧酶的微生物降解酚類(lèi)污染物
        1.7.2 制成生物傳感器檢測(cè)環(huán)境中的酚類(lèi)污染物
    1.8 雙加氧酶固定化方面的研究
    1.9 本課題研究?jī)?nèi)容與意義
第二章 雙加氧酶Tc3516與底物的分子對(duì)接以及突變位點(diǎn)的選擇
    2.1 引言
    2.2 配體、受體結(jié)構(gòu)的獲取
        2.2.1 獲取配體結(jié)構(gòu)
        2.2.2 獲取受體結(jié)構(gòu)——同源建模
            2.2.2.1 I-TASSER結(jié)構(gòu)模擬
            2.2.2.2 Easy Modeller同源模建
    2.3 確立受體蛋白的對(duì)接范圍
    2.4 進(jìn)行分子對(duì)接
    2.5 結(jié)果與討論
        2.5.1 Tc3516 與各突變體分子對(duì)接結(jié)果比較
            2.5.1.1 Tc3516與F301V
            2.5.1.2 Tc3516與D285A
            2.5.1.3 Tc3516與W292V
            2.5.1.4 Tc3516與D262A
            2.5.1.5 Tc3516與R256A
            2.5.1.6 Tc3516與H205V
        2.5.2 Docking相關(guān)參數(shù)
            2.5.2.1 受體結(jié)構(gòu)模擬時(shí)的自由能
            2.5.2.2 突變前后氨基酸殘基與底物之間的距離及疏水性
            2.5.2.3 受體二級(jí)結(jié)構(gòu)性質(zhì)參數(shù)
    2.6 小結(jié)
第三章 外二醇雙加氧酶Tc3516 與突變體的構(gòu)建、表達(dá)和純化
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 基因組提取
        3.3.2 雙加氧酶Tc3516 與突變體的構(gòu)建
            3.3.2.1 雙加氧酶Tc3516 基因與突變體的克隆
            3.3.2.2 雙加氧酶與突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.3.2.3 轉(zhuǎn)化與測(cè)序
        3.3.3 雙加氧酶與突變體的表達(dá)與純化
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 Tc3516 基因與突變體PCR、純化回收結(jié)果
        3.4.2 載體pET28a酶切及純化
        3.4.3 重組質(zhì)粒鑒定與測(cè)序
        3.4.4 蛋白優(yōu)化結(jié)果
2+-NTA親和層析">        3.4.5 Ni²⁺-NTA親和層析
    3.5 小結(jié)
第四章 雙加氧酶Tc3516 及突變體的酶學(xué)性質(zhì)表征
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 雙加氧酶活力測(cè)定方法
        4.3.2 雙加氧酶Tc3516 及突變體底物特異性的測(cè)定
        4.3.3 雙加氧酶Tc3516 及突變體最適p H的測(cè)定
        4.3.4 雙加氧酶Tc3516 及突變體最適溫度的測(cè)定
        4.3.5 雙加氧酶Tc3516 及突變體熱穩(wěn)定性的探究
        4.3.6 雙加氧酶Tc3516 及突變體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 反應(yīng)進(jìn)程曲線(xiàn)
        4.4.2 底物特異性測(cè)定結(jié)果
        4.4.3 最適pH測(cè)定結(jié)果
        4.4.4 最適溫度測(cè)定結(jié)果
        4.4.5 熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果
        4.4.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果
    4.5 小結(jié)
第五章 基于最優(yōu)突變體D285A的物理吸附固定化及連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)器的制備
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料
            5.2.2.1 載體材料
            5.2.2.2 試劑
            5.2.2.3 溶液配制
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 D285A與載體SBA-15 固定化
        5.3.2 固定化酶熱穩(wěn)定性檢測(cè)
        5.3.3 連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)器的制作及操作過(guò)程
        5.3.4 高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)污水處理率
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 固定化酶的固定效率及溫度穩(wěn)定性
        5.4.2 HPLC檢測(cè)連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)器的污水處理能力
            5.4.2.1 底物濃度與峰面積的線(xiàn)性擬合
            5.4.2.2 流速與重復(fù)利用次數(shù)對(duì)污水處理率的影響
            5.4.2.3 底物水解量與固定化酶活
    5.5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大豆過(guò)敏原11S球蛋白G2中A2鏈結(jié)合表位的預(yù)測(cè)[J]. 劉陽(yáng)星月,張迪,姚亞亞,苗字葉,劉壯,李慧靜.  食品科學(xué). 2018(18)
[2]細(xì)菌芳烴外二醇雙加氧酶研究進(jìn)展[J]. 許炳雯,李詩(shī)陽(yáng),張強(qiáng),曲媛媛,馬橋,李新亮,周集體,張旭旺,周豪.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2012(05)
[3]生物酶的定向進(jìn)化及其應(yīng)用[J]. 曾家豫,楊國(guó)兵,廖世奇.  衛(wèi)生職業(yè)教育. 2007(23)
[4]石油污染土壤中芳烴降解菌及鄰苯二酚2,3雙加氧酶的克隆[J]. 吳宇澄,駱永明,滕應(yīng),劉五星,李振高.  土壤. 2006(05)
[5]芳香烴雙加氧酶的結(jié)構(gòu)與功能研究[J]. 章儉,夏春谷.  化學(xué)進(jìn)展. 2004(01)
[6]點(diǎn)突變Pro229Ser和Glu243Gly對(duì)耐熱鄰苯二酚2,3-雙加氧酶性質(zhì)的影響[J]. 姜濤,季朝能,盛小禹,毛裕民.  遺傳學(xué)報(bào). 2001(03)
[7]耐熱鄰苯二酚2,3雙加氧酶的隨機(jī)突變研究[J]. 季朝能,徐明,姜濤,金詟,盛小禹,毛裕民.  云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 1999(S3)
[8]“復(fù)關(guān)”后進(jìn)口沖擊波的行業(yè)解析和對(duì)策[J]. 王賦,于培偉,張樹(shù)淼.  科技導(dǎo)報(bào). 1993(06)

博士論文
[1]基于受體和配體策略的計(jì)算機(jī)輔助農(nóng)藥生物合理設(shè)計(jì)研究[D]. 姚停停.浙江大學(xué) 2017
[2]大麥籽�？箖龅鞍椎闹苽浼翱箖鰴C(jī)制的研究[D]. 丁香麗.江南大學(xué) 2015
[3]耐熱對(duì)硝基苯酚磷酸酶的晶體結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定機(jī)制的研究[D]. 郭政.復(fù)旦大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3020343