雞球蟲屬于頂復(fù)器原蟲,鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）是頂復(fù)器原蟲Ca²⁺信號通路中的重要效應(yīng)分子,控制蟲體的滑移運(yùn)動、入侵細(xì)胞、蟲體發(fā)育等重要的生理過程,CDPKs僅存在于植物、綠藻、纖毛蟲及頂復(fù)器原蟲中。由于宿主沒有CDPKs,對球蟲CDPKs的功能以及在Ca²⁺信號通路中的作用進(jìn)行研究,將為開發(fā)新型抗球蟲藥物和研制球蟲疫苗提供重要的分子依據(jù)。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上,篩選柔嫩艾美耳球蟲CDPK4（EtCDPK4）的潛在互作蛋白,對潛在互作蛋白的特性進(jìn)行初步分析和相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。1.Co-IP、His pull down與質(zhì)譜技術(shù)篩選Et CDPK4互作蛋白收集與純化柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊（SO）,提取全蛋白,用Co-IP、His pull down與質(zhì)譜技術(shù)篩選獲得4個與EtCDPK4潛在互作的蛋白,分別為延伸因子1α（EtEF1α）、真核翻譯起始因子5A（EteIF-5A）、吡咯啉-5-羧酸還原酶（EtPYCR）和14-3-3蛋白（Et14-3-3）。2.四個潛在互作蛋白基因的克隆、原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析以柔嫩艾美耳球蟲孢子化... 

【文章來源】：上海師范大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

純化的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊

上海師范大學(xué)第2章Co-IP、Hispulldown與質(zhì)譜技術(shù)篩選EtCDPK4互作蛋白192.3.2柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊全蛋白的提取用RIPA蛋白裂解液裂解提取孢子化卵囊全蛋白，具體參照說明書進(jìn)行；首先在1.5mL離心管中加入孢子化卵囊和RIPA裂解液，再加入1/2體積的玻璃珠，充分震蕩破碎卵囊壁，顯微鏡下觀察無完整卵囊后離心，收集上清，即為孢子化卵囊全蛋白。采用SDS-PAGE法對提取的蛋白質(zhì)量進(jìn)行檢測，取20μL上清液，加入5μL的5×SDS上樣緩沖液，沸水浴5min，進(jìn)行凝膠電泳；結(jié)束后染色、脫色至出現(xiàn)清晰的條帶，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照（圖2-2）。結(jié)果顯示，所提取到的全蛋白條帶分明，分布均勻，沒有降解。圖2-2孢子化卵囊全蛋白M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:孢子化卵囊全蛋白Fig.2-2SporulatedoocystsproteinsM:ProteinmolecularweightMarker;1:Sporulatedoocystsproteins2.3.3rEtCDPK4蛋白的純化及兔抗rEtCDPK4抗血清IgG的收集篩選實(shí)驗(yàn)中用到的rEtCDPK4的重組蛋白已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室前期成功連接到pcoldI載體上并成功表達(dá)[90]，摸索到的表達(dá)條件為：加入1‰的IPTG，16℃誘導(dǎo)24h，誘導(dǎo)后使用His樹脂純化蛋白，SDS-PAGE分析結(jié)果表明表達(dá)的rEtCDPK4大小為66kDa（圖2-3A）。篩選實(shí)驗(yàn)中另外用到的兔抗rEtCDPK4多克隆抗體也已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室前期成功制備并儲存，我們使用ProteinA+G樹脂純化抗體，獲得兔抗rEtCDPK4的IgG；對收集到的IgG進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，收集到的IgG在25kDa和55kDa有兩條帶（圖2-3B），即IgG的輕鏈和重鏈，證明其質(zhì)量良好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

第2章Co-IP、Hispulldown與質(zhì)譜技術(shù)篩選EtCDPK4互作蛋白上海師范大學(xué)20圖2-3rEtCDPK4蛋白表達(dá)(A)及兔抗rEtCDPK4多抗IgG的純化(B)M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1:rEtCDPK4上清;2:rEtCDPK4沉淀;3:兔抗rEtCDPK4IgG(pH1.9)Fig.2-3Proteinexpression(A)andpurifiedIgGofrEtCDPK4(B)M:Proteinmolecularweightmarker;1:ThesupernatantofrEtCDPK4;2:TheprecipitatedofrEtCDPK4;3:Rabbitanti-rEtCDPK4IgG(pH1.9)2.3.4免疫共沉淀和Hispulldown銀染結(jié)果免疫共沉淀使用ThermoFisher提供的PierceCo-ImmunoprecipitationKit，具體步驟按照說明書進(jìn)行操作：將從兔抗rEtCDPK4多克隆抗體中純化的IgG首先結(jié)合在樹脂上，然后加入rEtCDPK4作為誘餌蛋白和提取到的孢子化卵囊全蛋白作為獵物蛋白，在樹脂上進(jìn)行特異性結(jié)合，收集洗脫液。Hispulldown實(shí)驗(yàn)按照ThermoFisher提供的PierceHisProteinInteractionPull-DownKit說明書進(jìn)行，即將rEtCDPK4作為誘餌蛋白，孢子化卵囊全蛋白作為獵物蛋白，分別在樹脂上孵育，最后收集洗脫液。將兩種方法收集到的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，蛋白膠上樣按照pulldown樣本組（pull-down-S）、pulldown陰性對照組（pull-down-N）、Co-IP樣本組（Co-IP-S）、Co-IP陰性對照組（Co-IP-N）的順序進(jìn)行，然后對蛋白膠進(jìn)行銀染分析（圖2-4）后送公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。2.3.5質(zhì)譜分析結(jié)果將兩種方法收集到的樣本進(jìn)行shotgun質(zhì)譜鑒定，與UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白比對，篩選出來的結(jié)果見圖2-5和表2-2。結(jié)果表明，Hispulldown樣本組篩選出70個潛在蛋白、Hispulldown陰性對照組篩選出136個潛在蛋白、Co-IP樣本組篩選出413個潛在蛋白、Co-IP陰性對照組篩選出370個潛在蛋白。我們對篩選的結(jié)果進(jìn)行分析處理，發(fā)現(xiàn)兩者中樣本組只篩選出了一種蛋白（圖2-5紅框），

【參考文獻(xiàn)】：
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