表皮細胞生長因子（Epidermal Growth Factor,EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF）都屬于細胞生長因子家族中的成員,有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。本研究針對人源EGF和bFGF基因序列設(shè)計了多個突變體,如:將EGF序列中第4位絲氨酸替換為蘇氨酸;在EGF序列中添加亮氨酸和蘇氨酸;將bFGF序列中第25位絲氨酸替換為半胱氨酸等。將合成的EGF和bFGF基因序列連接至融合了PLB1結(jié)構(gòu)域或DsbA伴侶標簽的pET-28a和pET-42a表達載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒,將測序結(jié)果比對正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中進行表達。實驗過程中,在搖瓶小試階段首先篩選出優(yōu)勢單克隆菌株,并進行建庫保存,發(fā)酵罐放大培養(yǎng)時考察不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對工程菌發(fā)酵密度值的影響,優(yōu)化EGF和bFGF融合蛋白的表達條件,其次對比不同的破壁緩沖液和洗脫緩沖液對菌體蛋白在層析柱中的分離特性和樣品組間分離度的影響,交替使用鎳離子親和層析和離子交換層析純化目的蛋白。最后采用MTT比色法檢測EGF和bFGF蛋白原液的生物學(xué)活... 

【文章來源】：河北科技大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

親和層析

ionBuffer洗脫后，將柱塞泵管頭插入到層析柜中的超純水試劑瓶中，沖洗使各基線水平后，將柱塞泵管頭插入到層析柜中的NI-StripBuffer試劑瓶中，對層析柱做脫鎳處理，直至層析柱顏色有淺藍變?yōu)榘咨�；⑧用超純水沖洗親和層析柱直至各基線水平，接著降低流速用1MNaOH清洗并短時間停留將柱塞泵管頭插入到層析柜中的NI-ChargeBuffer試劑瓶中重新掛鎳，最后用NI-StorageBuffer填滿層析柱放于層析柱儲存箱中保存。⑶目的蛋白進一步提純-離子交換層析離子交換層析（IEX）基于特定pH下的凈電荷差異從而達到分離生物分子的目的，如圖2-2所示，蛋白電荷取決于可電離氨基酸側(cè)鏈基團的數(shù)量和類型。不同蛋白具有不通的等電點，緩沖液pH低于蛋白等電點時，蛋白帶正電并將結(jié)合陽離子交換樹脂的帶負電荷的官能團，高于蛋白等電點時，蛋白是帶負電并將結(jié)合陰離子交換樹脂的帶正電荷的官能團。在保證蛋白穩(wěn)定的前提下下，即可選擇陽離子交換層析，又可選擇陰離子交換層析。操作方法①將純化實驗所需的玻璃容器、耗材等提前一天置于1MNaOH溶液中浸泡，次日配置實驗所需的各緩沖液于磁力攪拌器上充分混勻，調(diào)至所需pH值后，使用真空泵抽濾（0.45μm）除菌，將配好的試劑密封保存，放置層析柜中降溫至4℃，等圖2-2離子交換層析

第3章重組表皮細胞生長因子的制備及檢測27第3章重組表皮細胞生長因子的制備及檢測3.1構(gòu)建mPLB1-EGF工程菌3.1.1目的基因的表達設(shè)計從GenBank數(shù)據(jù)庫獲取EGF基因序列的相關(guān)信息，在保證其基本生物學(xué)功能的前提下，在天然EGF基因序列中添加1個亮氨酸、1個異亮氨酸和1個天冬氨酸，并將第4位絲氨酸替換為蘇氨酸，在C端引入6HisTag，兩端引入XhoI和NcoI酶切位點，將設(shè)計好的重組EGF序列委托公司合成，并做大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，將合成的含EGF目的基因序列的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XhoI和NcoI雙酶切，連接到融合了大消化鏈球菌proteinL的B1結(jié)構(gòu)域的pET-28a載體中，促使下游目的蛋白高效表達和誘導(dǎo)自折疊，如圖3-1所示，重組EGF質(zhì)粒構(gòu)建完成后進行相應(yīng)的檢測實驗。3.1.2目的基因的重組與轉(zhuǎn)化⑴質(zhì)粒提取提取pET-28a載體質(zhì)粒和EGF目的基因質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖3-2所示，由電泳圖可看出條帶明亮，證明質(zhì)粒提取成功，用限制性內(nèi)切酶XhoI和NcoI雙酶切EGF目的基因質(zhì)粒和pET-28a載體質(zhì)粒，按照限制性內(nèi)切酶說明書配比酶切體系。按照水，Buffer，質(zhì)粒DNA，酶的先后順序加入到PCR管中。M：DNA分子量標準品1：pET-28a載體質(zhì)粒；2~6：EGF目的基因質(zhì)粒圖3-2目的基因和載體質(zhì)粒電泳分析圖3-1重組EGF質(zhì)粒構(gòu)建

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]重組大腸桿菌表達包涵體藥物蛋白的復(fù)性與純化研究[D]. 何偉.華東理工大學(xué) 2017
[4]人表皮細胞生長因子在大腸桿菌中的高效表達及功能鑒定[D]. 吳少敏.華南理工大學(xué) 2016
[5]十種常見栽培食用菌菌種保藏及菌種擴大工藝優(yōu)化[D]. 孫磊.魯東大學(xué) 2016
[6]EGF在糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合過程中的作用及機制[D]. 劉如俊.大連醫(yī)科大學(xué) 2014
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本文編號：2982635