發(fā)布時間：2021-01-10 07:27

　　H9N2亞型低致病性禽流感病毒（LPAIV）在世界各地廣泛流行,與其他細菌的共感染尤其是與大腸桿菌的混合感染導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)蒙受嚴重的經(jīng)濟損失。雖然H9N2病毒感染已被證明可促進細菌感染,但其機制尚不清楚。通過實驗室前期研究,初步篩選了一些可能與細菌粘附相關(guān)的蛋白如TGF-β1、整合蛋白、皮層蛋白、鈣粘蛋白、黏著斑蛋白、纖調(diào)蛋白等。其中TGF-β1作為一種免疫調(diào)節(jié)因子和促炎因子能夠介導(dǎo)某些細菌粘附。目前關(guān)于TGF-β1的大部分研究主要集中在人源,而關(guān)于雞TGF-β1（與人源的氨基酸序列同源性僅約60%）與禽病原菌感染之間相關(guān)性的研究尚未有報道。雞TGF-β1蛋白可能在H9N2病毒誘導(dǎo)的繼發(fā)性大腸桿菌感染中發(fā)揮重要的作用,但是其中更為詳細的機制還仍不清楚。因此,本研究以病毒、細菌和宿主之間的關(guān)系為基礎(chǔ),揭示參與H9N2 AIV引起的繼發(fā)性細菌感染的宿主因素,提供一種解釋流感病毒和細菌之間的協(xié)同致病機制的新的理論依據(jù),有望為抗感染藥物的研究提供潛在的分子靶點。本研究分為以下三個部分:1.H9N2 AIV對大腸桿菌粘附宿主的能力及特性分析將雞胚成纖維細胞（DF-1）在6孔細胞板上培養(yǎng),長至單層后隨... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組pET-28a(+)-TGF-β1質(zhì)粒雙酶切鑒定圖

雞TGF-β1在H9N2禽流感病毒誘導(dǎo)感染大腸桿菌中的作用24ABC圖2重組蛋白TGF-β1的SDS-PAGE(A、B)、和Westernblot分析(C)Fig.2SDS-PAGEandWesternblotoftheTGF-β1注：（A）不同誘導(dǎo)時間下的SDS-PAGE鑒定圖。M：蛋白Marker；1:陰性對照4-5依次為誘導(dǎo)表達2h、4h、6h、8h時的產(chǎn)物；（B）純化后SDS-PAGE鑒定圖。其中M：蛋白Marker；1：柱層析流出液；2：經(jīng)純化的表達產(chǎn)物。（C）Westernblot鑒定圖。右圖為WB鑒定圖。其中M：蛋白Marker；1：誘導(dǎo)表達產(chǎn)物；2：陰性對照。Note:thedrawingistheSDS-PAGEidentificationmapunderdifferentinductiontime.M:Proteinmarker;1:negativecontrol4-5wastheproductofinducedexpressionfor2h,4h,6hand8hinturn;themiddlepicturewastheSDS-PAGEidentificationpictureafterpurification.Amongthem,M:proteinmarker;1:columnchromatographyeffluent;2:purifiedexpressionproduct.(C)Westernblotidentificationmap.M:Proteinmarker;1:inducedexpressionproduct;2:negativecontrol.3.2H9N2AIV對宿主細胞黏附大腸桿菌能力的影響3.2.1H9N2AIV可以增強DF-1細胞對大腸桿菌的粘附能力向長滿單層的DF-1細胞接種100MOI（PFU/cell）的H9N2AIV，感染24h進行細胞間接免疫熒光；同時向細胞孔接種100MOI（CFU/cell）的大腸桿菌，將細胞板離心后4℃孵育1.5h，收集細胞，用涂布法對大腸桿菌進行計數(shù)。結(jié)果顯示，可以在DF-1細胞中檢測到H9N2病毒（圖3A和3B）；與未感染H9N2組相比，DF-1細胞感染H9N2后粘附的大腸桿菌數(shù)顯著升高（圖3C，P<0.05）。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文25圖3H9N2AIV感染前后細胞間接免疫熒光（B）和（A）以及DF-1細胞對大腸桿菌的粘附能力變化（C）Fig.3Indirectimmunofluorescence(B)and(A)beforeandafterH9N2AIVinfectionandthechangeofadhesionabilityofE.colitoDF-1cells(C)3.2.2H9N2AIV可以增強SPF雞體對大腸桿菌的粘附能力將1周齡的SPF雞鼻腔接種106.375TCID50的H9N2病毒，接種第3天向雞鼻腔接種106CFU的APEC菌液1.0mL，H9N2病毒感染7d后然后取雞的氣管、肺臟，使用多聚甲醛固定，制作病理組織切片并進行HE染色。同時，用組織切片間接免疫熒光檢測H9N2病毒是否在SPF雞肺中定位。檢測雞肺中大腸桿菌的載量，用涂布法進行計數(shù)。病理組織切片結(jié)果表明，H9N2感染后氣管沒有發(fā)生明顯的病理變化（圖4A和4B），可以觀察到少量肺泡結(jié)構(gòu)塌陷和炎性細胞聚集（圖4C和4D）；免疫熒光結(jié)果表明，可以在SPF雞肺組織中檢測到H9N2病毒（圖4E和4F）；大腸桿菌粘附結(jié)果顯示，SPF雞感染H9N2病毒后，雞肺內(nèi)大腸桿菌的相對粘附數(shù)量顯著上升（圖4G）。ABC


本文編號：2968317