發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 07:38

　　 布魯氏菌病(Brucellosis)是布魯氏菌(Brucella)引起的人獸共患性疾病,嚴(yán)重威脅人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展。布魯氏菌作為兼性胞內(nèi)寄生菌,其分泌系統(tǒng)和分泌蛋白在增殖和擴(kuò)散過程中都發(fā)揮著重要作用。為了進(jìn)一步確定布魯氏菌中所包含的主要分泌系統(tǒng)的分布情況,使用MacSyFinder結(jié)合TXSSdb、SSPred、T346Hunter數(shù)據(jù)庫中的模型,對B.abortus 2308,B.melitensis 16M,B.suis 1330等不同種型的18株布魯氏菌基因組進(jìn)行分析。結(jié)果顯示18株布魯氏菌中均具有Ⅳ、Ⅴ型分泌系統(tǒng),不存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ型分泌系統(tǒng)。除了Brucella melitensis ATCC 23457中不含有T5cSS外,其他菌株中都含有V型分泌系統(tǒng)T5aSS和T5cSS的兩種亞型,但是在數(shù)量上存在一定的差異。目前文獻(xiàn)報(bào)道的布魯氏菌分泌蛋白有28個(gè),其中15個(gè)蛋白經(jīng)Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌。布魯氏菌的分泌蛋白在其復(fù)制增殖以及逃避宿主免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮了重要作用。為了挖掘新的布魯氏菌分泌蛋白,進(jìn)一步探索布魯氏菌的致病機(jī)制,本研究使用S4TE 2.0和EffectiveDB程序,對B.abortus 2308株基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,預(yù)測出193個(gè)候選分泌蛋白,其中染色體I中138個(gè),染色體II中55個(gè)。以B.abortus 2308為模板構(gòu)建重組pZL1790載體64個(gè),根據(jù)TEM-1報(bào)告系統(tǒng)判定標(biāo)準(zhǔn),兩個(gè)重組載體呈現(xiàn)陽性結(jié)果。根據(jù)蛋白分子量大小分別命名為Bsec24和Bsec103。EggNOG蛋白功能注釋結(jié)果顯示,Bsec24為酯酶/脂肪酶/硫酯酶,Bsec103為核糖核酸酶E和G。為了進(jìn)一步研究分泌蛋白Bsec24和Bsec103對布魯氏菌毒力的影響,研究分別構(gòu)建了分泌蛋白基因缺失株2308ΔBsec24和2308ΔBsec103。將缺失株和親本株B.abortus 2308分別感染RAW264.7細(xì)胞,監(jiān)測細(xì)胞載菌量的變化。結(jié)果顯示2308ΔBsec24株感染后細(xì)胞載菌量與親本株無明顯差異,2308ΔBsec103株感染48h的細(xì)胞載菌量明顯低于親本株。進(jìn)一步分析感染48小時(shí)的B.abortus 2308株感染組和2308ΔBsec103株感染組RAW264.7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),結(jié)果顯示,與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的基因Cryab和Casp12表達(dá)量顯著升高,提示Bsec103蛋白可能在調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中發(fā)揮了重要作用。
【學(xué)位單位】：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

R囊泡融合，來促進(jìn)布魯氏菌增殖。在Yip1A敲除的細(xì)胞中，布魯氏菌不能形成rBCV，使其保留在溶酶體內(nèi)。IRE1的敲除導(dǎo)致IRE1α途徑不能被激活，呈現(xiàn)相同現(xiàn)象[13]。Yip1A激活UPR的IRE1α通路后，Atg9和WIPI1在ERES募集，并上調(diào)ER衍生的細(xì)胞質(zhì)被膜復(fù)合體Ⅱ(ThecoatproteincomplexⅡ,COPⅡ)的組分Sar1、Sec23和Sec24D，增強(qiáng)COPⅡ囊泡從ERES分泌的能力。研究表明COPⅡ囊泡是自噬體膜的來源，在自噬體形成過程中起到重要作用[14]。自噬相關(guān)蛋白在rBCV向aBCV的轉(zhuǎn)化中起重要作用，而Yip1A在布魯氏菌的復(fù)制和aBCV的形成中也是必需的。圖1.1布魯氏菌的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)模型(自繪)Figure1.1IntracellulartransportmodelofBrucella(byauthor)BCV酸化(pH降低至4.0-4.5)是BCV成熟過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，酸性環(huán)境有助于布魯氏菌VirB操縱子的表達(dá)[15]，VirB操縱子調(diào)控的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeIVsecretionsystem,T4SS)對其胞內(nèi)生存是必須的。除了T4SS以外，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-componentregulatorysystem,BvrS/BvrR)、環(huán)狀β-葡聚糖(cyclicβ-glucan)、LuxR樣轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(LuxR-liketranscriptionalregulator,VjbR)、布魯氏脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、鞭毛樣結(jié)構(gòu)(flagellum-likestructure)、類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

芓LR4和TLR2信號傳導(dǎo)[40]。通過這種方式，布魯氏菌抑制DC的成熟和促炎細(xì)胞因子IL-12和TNF-α等的產(chǎn)生。此外，該蛋白質(zhì)還抑制了CD8+T細(xì)胞對布魯氏菌靶細(xì)胞的殺傷作用[41]。效應(yīng)蛋白BspB通過與保守的寡聚高爾基體(conservedoligomericGolgi,COG)相互作用，調(diào)節(jié)COG依賴性運(yùn)輸，將高爾基體衍生的囊泡重定向到BCV，促進(jìn)rBCV的形成，從而促進(jìn)布魯氏菌的胞內(nèi)增殖[42]。布魯氏菌二氧四氫喋啶合成酶(BrucellaLumazineSynthase,BLS)通過TLR4傳遞信號，誘導(dǎo)DC成熟和CD8+T細(xì)胞毒性作用，來抑制腫瘤生長，調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[43]。圖1.2宿主細(xì)胞對布魯氏菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)[19]Figure1.2ImmuneresponseofhostcellstoBrucella[19]1.3.3布魯氏菌逃避宿主免疫反應(yīng)的其他機(jī)制1.3.3.1布魯氏菌抑制細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一種調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的方式，通常由半胱天冬氨酸水解酶(Caspase)啟動，促進(jìn)對胞內(nèi)寄生菌的防御性反應(yīng)。抑制感染細(xì)胞的凋亡也是布魯氏菌維持其胞內(nèi)存活的重要逃逸方式。布魯氏菌感染后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣水平上調(diào)是其在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的重要因素之一。感染后胞內(nèi)鈣依賴的E3泛素連接酶Nedd4的活性顯著增加，通過降解鈣依賴性蛋白酶calpain2，抑制巨噬細(xì)胞凋亡[44]。此外，鋅指蛋白A20會影響腫瘤壞死因子受體1(tumornecrosisfactorreceptor1，TNFR1)的信號通路，同時(shí)抑制巨噬細(xì)胞活化和凋亡。A20上調(diào)導(dǎo)致NF-κB通路的抑

AAAGCTCTTTGACCGGTTG58BAB2_0223CGggatccATGGCGGCTTCGCTTGGC273CCGctcgagTTATTGCACCTGAACCTTCGG59BAB2_0077CGggatccATGGCGAGAGAAAAATGGCA1446CCGctcgagTCAGCGGACCAGAACGTTGC60BAB2_0628ATGACGAAAAGCGTAATGATCGTG372CTAGGCATCGCCCAGATAGGACT61BAB2_0635TTGGCACGCCGTTTTTCCAAATC2352TCAGTGACCTCTCCTCTTGTG62BAB2_0208ATGCAGAAGAAGAAGGGCGG744TCATTTCGCTTTCTCCAATGCTGC63BAB2_0636ATGAACGTCGTCGTCGTCGAATC2634TTACTCCTCTGCCGCCTTG64BAB2_0665ATGTCCAGCACGAAGACAATCG618TTATTTGGCAGCGCCTTTTGCC圖3.1pZL1790質(zhì)粒圖譜Figure3.1TheplasmidprofileofpZL1790
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1 謝士杰;布魯氏菌分泌蛋白的篩選及Bsec103蛋白功能的初步研究[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2020年

本文編號：2872851