本文以人乳腺癌細胞MCF-7為研究對象,在小瓶培養(yǎng)的基礎上,對MCF-7進行規(guī)模放大培養(yǎng),建立了MCF-7的滾瓶培養(yǎng)方法,然后研究了軟骨多糖對MCF-7的誘導凋亡作用及其作用機理。本研究首先以滾瓶轉(zhuǎn)速為變量,通過單因素試驗確定了MCF-7滾瓶培養(yǎng)的滾瓶初期轉(zhuǎn)速范圍和貼壁后轉(zhuǎn)速范圍。然后以接種量、培養(yǎng)液添加量和培養(yǎng)時間為自變量,進行了三因素三水平的正交試驗,通過分析得出對細胞產(chǎn)量影響極顯著的因素為接種量和培養(yǎng)時間,根據(jù)正交試驗的結(jié)果確定了滾瓶培養(yǎng)MCF-7的最佳方案為初期轉(zhuǎn)速15r/h,貼壁后轉(zhuǎn)速40r/h,接種量為5×107個細胞,培養(yǎng)時間96h,培養(yǎng)基用量150mL。在確立了MCF-7的滾瓶培養(yǎng)方法后,研究了軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)MCF-7細胞的凋亡作用。Hochest33342/PI雙染色、Annexin V-FITC/PI 和 DNA Ladder等實驗結(jié)果都表明MCF-7細胞在軟骨多糖作用后出現(xiàn)典型的凋亡現(xiàn)象。通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)在軟骨多糖作用12h,24h的MCF-7凋亡率分別為20.23%和44.7%；同時發(fā)現(xiàn)MCF-7細胞在軟骨多糖作用后,細胞周期被阻滯在了S期。通過二維電泳技術分析了正常MCF-7細胞和與軟骨多糖共培養(yǎng)MCF-7細胞的全蛋白圖譜,發(fā)現(xiàn)10個具有表達差異的蛋白點,其中7個蛋白點的表達量下調(diào),3個蛋白點表達量上調(diào)。選取其中表達差異最顯著的3個蛋白點,通過MALDI-TOF-MS/MS進行鑒定,共鑒定出2個差異表達蛋白,其中一個為肌動蛋白actin,其表達下調(diào)誘導線粒體凋亡途徑,另一個為抗氧化類蛋白PRDX6,其表達降低,導致細胞發(fā)生氧化損傷凋亡。
【學位單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：Q813;R737.9
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 細胞培養(yǎng)技術及應用
        1.1.1 動物細胞培養(yǎng)技術概述
        1.1.2 細胞培養(yǎng)技術在抗腫瘤研究中的應用
    1.2 乳腺癌概述
        1.2.1 乳腺癌發(fā)展及現(xiàn)狀
        1.2.2 乳腺癌的發(fā)病機制及治療
    1.3 多糖概述
        1.3.1 多糖的分類
        1.3.2 多糖的活性
    1.4 細胞凋亡概述
        1.4.1 細胞凋亡的特征
        1.4.2 細胞凋亡的作用機理及調(diào)控
        1.4.3 研究細胞凋亡應用于乳腺癌治療的展望
    1.5 蛋白質(zhì)組學在細胞凋亡研究中的應用
        1.5.1 蛋白質(zhì)組學的概念
        1.5.2 蛋白質(zhì)組學相關技術及在細胞調(diào)亡研究中的應用
    1.6 本課題的研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要試劑及藥品
        2.1.2 實驗儀器與設備
        2.1.3 實驗細胞及軟骨多糖制備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 MCF-7細胞系的維持
        2.2.2 MCF-7細胞滾瓶培養(yǎng)條件的研究
        2.2.3 MCF-7細胞與軟骨多糖在滾瓶中共培養(yǎng)
        2.2.4 轉(zhuǎn)瓶細胞觀察臺對MCF-7細胞形態(tài)的觀察
        2.2.5 Hoechst33342/PI雙染檢測軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)的MCF-7的凋亡作用
        2.2.6 Annexin V-FITC/PI染檢測軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)MCF-7的凋亡作用
        2.2.7 DNA Ladder法檢測軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)的MCF-7的凋亡作用
        2.2.8 流式細胞術分析軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)的MCF-7細胞周期的影響
        2.2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）比較MCF-7蛋白差異
        2.2.10 利用雙向電泳結(jié)合MALDI-TOF分析MCF-7凋亡前后差異蛋白
3 結(jié)果與討論
    3.1 MCF-7細胞的滾瓶培養(yǎng)條件
        3.1.1 轉(zhuǎn)速范圍
        3.1.2 培養(yǎng)時間
        3.1.3 培養(yǎng)液用量
        3.1.4 正交法優(yōu)化培養(yǎng)條件
    3.2 轉(zhuǎn)瓶細胞觀察臺觀察軟骨多糖對MCF-7的作用
    3.3 Hoechst33342/PI雙染色檢測MCF-7的凋亡作用
    3.4 Annexin V FITC-PI對MCF-7的凋亡檢測結(jié)果
    3.5 凋亡細胞DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果
    3.6 流式細胞術測定MCF-7細胞周期結(jié)果
    3.7 SDS-PAGE分析MCF-7凋亡前后蛋白
    3.8 二維電泳結(jié)合MALDI-TOF-MS/MS分析結(jié)果
        3.8.1 二維電泳結(jié)果
        3.8.2 差異表達蛋白MADI-TOF-MS/MS質(zhì)譜分析結(jié)果
4 結(jié)論
5 展望
6 參考文獻
7 致謝

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1 魏欣;MCF-7的滾瓶培養(yǎng)及軟骨多糖誘導其凋亡的作用研究[D];天津科技大學;2015年

本文編號：2853284