兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)即兔瘟,由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的一種烈性病毒病,特點(diǎn)是主要臟器出血,急性一般2-3天死亡,3月齡以上家兔發(fā)病率達(dá)90-100%,病死率高達(dá)95%。1984年兔瘟在我國江蘇無錫、江陰等地首次發(fā)生,快速發(fā)展到我國大部分地區(qū),并逐步蔓延到世界各個(gè)國家,給家兔養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害。由于抗生素對(duì)兔瘟治療無效,干擾素免疫調(diào)節(jié)增效作用不能徹底治愈兔瘟,目前,對(duì)兔瘟的控制以免疫預(yù)防為主,常用的疫苗是組織滅活疫苗,雖然組織滅活疫苗在控制兔瘟上發(fā)揮了重要的作用,但這種傳統(tǒng)疫苗存在成本高,易散毒、不易保存等缺點(diǎn)。相比傳統(tǒng)疫苗,基因疫苗具有安全性更高、成本更低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)從兔瘟病毒四川株(Y8504)克隆VP60基因構(gòu)建重組真核質(zhì)粒,并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了研究,以期為兔瘟基因疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。依據(jù)GenBank上公布的RHDV的VP60序列設(shè)計(jì)特異性引物,使用RT-PCR擴(kuò)增RHDV的VP60基因,片段大小為1740bp,將得到的產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到pMD19-T載體,獲取重組質(zhì)粒pMD19-T-VP60,并序列測(cè)定。將測(cè)序無誤的pMD19-T-VP60經(jīng)EcoR I與Xho I雙酶切后,將目的基因VP60插入真核表達(dá)載體pVAX-1,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-VP60。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pVAXl-VP60按500μ.g/只腿部肌肉注射25日齡家兔,同時(shí)設(shè)pVAX-1組、兔瘟組織滅活苗組和PBS組。于免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d對(duì)各組兔靜脈采血,使用ELISA法檢測(cè)血清中特異性抗體,PBS組和pVAX-1組未檢測(cè)到特異性抗體,pVAX1-VP60組和兔瘟組織滅活苗組家兔都能產(chǎn)生高水平的特異性抗體,在特異性抗體水平高峰期,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組血清抗體水平差異不顯著(p0.05)。在免疫后3d,7d,14d,21d,28d,35d,42d對(duì)pVAXl-VP60組隨機(jī)處死3只,取心,肝,脾,肺,腎,肌肉組織,進(jìn)行質(zhì)粒在組織內(nèi)分布的PCR檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組織均有基因VP60的分布。免疫后28天以滴度108的RHDV 0.5mL/只腿部肌肉注射攻毒,pVAX-1組、PBS組、兔瘟組織滅活苗組、pVAX1-VP60組的相對(duì)保護(hù)率分別為0%、0%、90%、85%,表明pVAX1-VP60具有良好的免疫效果。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 兔瘟概況
        1.1 流行病學(xué)特點(diǎn)
        1.2 臨床癥狀及病理變化
            1.2.1 臨床癥狀
            1.2.2 病理特點(diǎn)
            1.2.3 組織病理
    2 RHDV基因組與基因工程疫苗
        2.1 RHDV基因組
        2.2 兔瘟基因工程亞單位疫苗及病毒活載體疫苗
            2.2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)
            2.2.2 昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)
            2.2.3 酵母表達(dá)系統(tǒng)
            2.2.4 植物表達(dá)系統(tǒng)
            2.2.5 重組病毒表達(dá)系統(tǒng)
        2.3 核酸疫苗發(fā)展概況
            2.3.1 核酸疫苗的概念
            2.3.2 核酸疫苗的作用機(jī)理
            2.3.3 DNA疫苗的結(jié)構(gòu)
            2.3.4 真核表達(dá)載體pVAX-1
            2.3.5 核酸疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)
    3 質(zhì)粒組織分布
    4 研究目的及意義
第二章 兔瘟病毒四川株（Y8504）的分離鑒定
    1 材料
        1.1 試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2 方法
        2.1 臨床癥狀及病理剖解
        2.2 毒株P(guān)CR檢測(cè)
            2.2.1 引物設(shè)計(jì)
            2.2.2 RNA提取
            2.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄
            2.2.4 PCR擴(kuò)增目的基因
        2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析
    3 結(jié)果
        3.1 臨床癥狀與剖解變化
        3.2 目的基因的RT-PCR擴(kuò)增與鑒定
        3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析
    4 討論
第三章 兔瘟病毒VP60基因重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建
    1 材料
        1.1 毒株與載體
        1.2 試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 培養(yǎng)基
    2 方法
        2.1 目的基因獲取
            2.1.1 引物設(shè)計(jì)
            2.1.2 RNA提取
            2.1.3 反轉(zhuǎn)錄
            2.1.4 PCR擴(kuò)增VP60
            2.1.5 膠回收
        2.2 pMD19-T-VP60質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.1 感受態(tài)細(xì)胞制備
            2.2.2 目的基因的T/A連接及轉(zhuǎn)化
            2.2.3 pMD19-T-VP60質(zhì)粒抽提和酶切檢測(cè)
            2.2.4 pMD19-T-VP60雙酶切
        2.3 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-VP60的構(gòu)建
            2.3.1 感受態(tài)細(xì)胞制備
            2.3.2 連接轉(zhuǎn)化
            2.3.3 pVAXl-VP60質(zhì)粒抽提和酶切檢測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 VP60基因的RT-PCR擴(kuò)增與鑒定
        3.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-VP60的構(gòu)建與鑒定
        3.3 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VP60的構(gòu)建與鑒定
    4 討論
第四章 兔瘟病毒VP60基因真核質(zhì)粒免疫性研究
    1 材料
        1.1 重組真核表達(dá)質(zhì)粒與載體
        1.2 試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 培養(yǎng)基
        1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2 方法
        2.1 重組質(zhì)粒pVAX1-VP60的大量制備
        2.2 重組質(zhì)粒pVAX1-VP60免疫家兔及抗體檢測(cè)
            2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組
            2.2.2 重組質(zhì)粒pVAX1-VP60免疫家兔后血清制備
            2.2.3 抗體檢測(cè)原理
            2.2.4 重組質(zhì)粒免疫家兔后的抗體檢測(cè)
        2.3 重組質(zhì)粒pVAXl-VP60在兔體內(nèi)分布檢測(cè)
            2.3.1 免疫后采樣
            2.3.2 DNA提取
            2.3.3 重組質(zhì)粒pVAX1-VP60的PCR檢測(cè)
        2.4 免疫保護(hù)率
            2.4.1 紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)（HA）
            2.4.2 攻毒實(shí)驗(yàn)
    3 結(jié)果
        3.1 重組質(zhì)粒pVAX1-VP60免疫家兔特異性抗體檢測(cè)
        3.2 重組質(zhì)粒pVAXl-VP60免疫家兔后組織分布
        3.3 攻毒實(shí)驗(yàn)
    4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)（References）
致謝
作者攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

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