胸腺嘧啶脫氧核苷磷酸化酶(Thymidine Phosphorylase,TP)是一種核苷磷酸化酶,它在微生物和真核生物體內(nèi)普遍存在,在核苷酸代謝過(guò)程尤其是補(bǔ)救合成途徑中發(fā)揮重要作用,通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用可催化生成多種核苷類化合物。但目前工業(yè)中用來(lái)制備核苷類化合物的方法主要是化學(xué)法,化學(xué)法的反應(yīng)條件要求高,步驟較繁瑣且污染環(huán)境。而近年來(lái)興起的酵母表面展示技術(shù)可以集酶的表達(dá)、純化和固定于一體的,催化效率高,是一種可重復(fù)利用且處理工藝簡(jiǎn)單的催化平臺(tái)。本文分別基于兩種不同的錨定系統(tǒng),構(gòu)建了TP的畢赤酵母和釀酒酵母表面展示系統(tǒng),探索了將其作為全細(xì)胞催化劑制備核苷類化合物的可能性。本文從大腸桿菌K12菌株中克隆編碼TP的deo A基因,利用酵母表達(dá)質(zhì)粒p KFS構(gòu)建了重組質(zhì)粒p KFS-LA,電擊轉(zhuǎn)入GS115細(xì)胞,構(gòu)建了畢赤酵母的重組轉(zhuǎn)化子。高拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)96 h后,免疫熒光結(jié)果顯示TP在酵母細(xì)胞表面成功展示。利用30 m M的!-胸苷為底物,重組酵母細(xì)胞作為全細(xì)胞催化劑,在50℃下反應(yīng)2 h。經(jīng)HPLC檢測(cè)結(jié)果表明展示在酵母表面的TP具有催化活性,可以催化!-胸苷生成產(chǎn)物胸腺嘧啶,轉(zhuǎn)化率為7.5%。另外,本論文同時(shí)利用酵母表達(dá)質(zhì)粒p YD1構(gòu)建了重組質(zhì)粒p YD1-deo A,利用PEG1000化學(xué)轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBY100菌株,構(gòu)建了釀酒酵母轉(zhuǎn)化子。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)48 h后,進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),結(jié)果表明TP成功表達(dá)在釀酒酵母表面;在50℃下以釀酒酵母轉(zhuǎn)化子為全細(xì)胞催化劑反應(yīng)2 h,對(duì)30 m M!-胸苷的催化活性經(jīng)HPLC檢測(cè)為10.87%。利用釀酒酵母轉(zhuǎn)化子為催化劑,通過(guò)對(duì)其他核苷類化合物如5-氮雜胞苷的催化反應(yīng)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)TP具有較高的底物特異性,可以催化尿嘧啶核苷類化合物,但無(wú)法催化胞嘧啶核苷類化合物的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)。本論文利用酵母表面展示技術(shù),成功構(gòu)建了胸苷磷酸化酶的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化子,且均具有催化活性。本課題為利用生物酶法合成核苷類化合物及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q78
【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要符號(hào)對(duì)照表
第1章 引言
    1.1 核苷類化合物的介紹
    1.2 重要核苷類化合物的制備
    1.3 核苷磷酸化酶
    1.4 微生物表面展示技術(shù)
    1.5 課題研究目的和意義
    1.6 論文各部分主要內(nèi)容
第2章 胸苷磷酸化酶的畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 設(shè)備和儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)流程
        2.2.2 PCR擴(kuò)增目的基因
        2.2.3 構(gòu)建目的基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒
        2.2.4 畢赤酵母GS115細(xì)胞感受態(tài)的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.2.5 Western blot驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)
        2.2.6 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 酵母轉(zhuǎn)化子的催化活性檢測(cè)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.3.1 胸苷磷酸化酶基因的克隆
        2.3.2 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pKFS-LA的構(gòu)建
        2.3.3 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選
        2.3.4 目的蛋白在GS115細(xì)胞表面展示情況的檢測(cè)
        2.3.5 目的蛋白的western blot檢測(cè)
        2.3.6 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的催化活性檢測(cè)
    2.4 本章小結(jié)
第3章 胸苷磷酸化酶的釀酒酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 設(shè)備和儀器
        3.1.4 培養(yǎng)基
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)流程
        3.2.2 PCR擴(kuò)增目的基因
        3.2.3 構(gòu)建目的基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒
        3.2.4 EBY100酵母細(xì)胞感受態(tài)的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.2.5 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
        3.2.6 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 酵母轉(zhuǎn)化子的催化活性檢測(cè)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.3.1 胸苷磷酸化酶基因的克隆
        3.3.2 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pYD1-deoA的構(gòu)建
        3.3.3 釀酒酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選
        3.3.4 釀酒酵母細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)
        3.3.5 目的蛋白在酵母細(xì)胞表面展示情況的檢測(cè)
        3.3.6 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
        3.3.7 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的催化活性檢測(cè)
    3.4 本章小結(jié)
第4章 結(jié)論及展望
    4.1 結(jié)論
    4.2 其它研究工作
    4.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果

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