卡那霉素是氨基糖苷類抗生素中的重要一員,一方面具有價(jià)格便宜、高效和過敏反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用,另一方面環(huán)境中抗生素的殘留極大促進(jìn)耐藥性的產(chǎn)生,對醫(yī)療保健是一大威脅。本研究主要有以下幾個(gè)方面：篩選卡那霉素降解菌,研究降解菌生長和降解特性,及其處理卡那霉素廢水和菌渣的效果；研究從降解菌中提取的卡那霉素降解酶酶學(xué)活性,為其應(yīng)用于處理環(huán)境中抗生素殘留提供理論基礎(chǔ)；通過物理、化學(xué)、生物法對卡那霉素發(fā)酵菌渣改性,重新用做發(fā)酵培養(yǎng)基氮源；通過卡那鏈霉菌誘變育種,提高卡那霉素產(chǎn)量。本論文主要內(nèi)容和結(jié)果如下：1.通過利用卡那霉素為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基,從卡那霉素富集土壤和活性污泥中篩選出3株高效降解菌,A1、A2和A3。三個(gè)株菌均為革蘭氏陰性菌,其中降解菌A2降解能力最強(qiáng),經(jīng)過16sDNA和生理生化鑒定,A1、A2屬于副球菌Paracoccus kondratievae, A3屬于Aquamicrobium sp。2.研究了降解菌A2生長和降解特性。A2在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),0-5 h處于延遲期、5 h后進(jìn)入對數(shù)期、11 h進(jìn)入穩(wěn)定期；利用logistics方程分析發(fā)現(xiàn),添加0、200 mg/L.1000 mg/L卡那霉素,A2的生長曲線僅初始階段對降解菌具有抑制作用,濃度越大抑制作用越強(qiáng)；A2最適生長條件為pH6-9,37℃; 1mM的Cd2+抑制A2的生長,1 mM-10 mM的Mg2+對A2的生長有微弱的促進(jìn)作用,10 mM的Zn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Fe3+、Ca2+、Ba2+、Cd2+和Mn2+對A2的生長有不同程度的抑制作用：A2也能在100 mg/L的鏈霉素和慶大霉素的培養(yǎng)基中生長。在以卡那霉素為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),降解菌A2能耐受高達(dá)16000mg/L的卡那霉素,最適降解溫度37℃；外加0.2%的葡萄糖、麥芽糖、牛肉膏、酵母膏、淀粉和蛋白胨對A2的降解能力有不同程度的促進(jìn)作用,甘露醇和蔗糖對A2降解能力有所抑制；基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加0.2%的MgSO4皂極大促進(jìn)A2的生長；外加0.05%不同金屬離子,除Fe3+對A2的降解能力影響不顯著,Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ni2、Cd2+、Zn。+和A13+都對A2的降解能力有不同程度抑制作用。3.研究了降解菌株A2處理卡那霉素廢水的降解效果：廢水中卡那霉素濃度高低對其完全降解所需要的時(shí)間有顯著影響,25%濃度卡那霉素廢水在24 h內(nèi)可完全降解,100%濃度廢液中的卡那霉素很難被完全降解,72h仍有3.21 mg/L殘留；A2菌株對過濾除菌廢水和未除菌廢水的降解效果相當(dāng),但前者生物量要高于后者,說明廢水中其他微生物的存在對A2的降解能力無顯著的影響。4.利用降解菌株A2處理卡那霉素發(fā)酵菌渣：處理24 h內(nèi)具有較高的降解效率；接種量按菌渣質(zhì)量的10%-70%,接種量越高,A2對菌渣中卡那霉素降解率越高,當(dāng)接種量從1O%增加到30%,對降解率提升幅度最大,達(dá)34.13%；菌渣的加水量按菌渣質(zhì)量的30%-90%-著影響卡那霉素降解,水分越多,降解效果越好,對比加水量90%和120%,卡那霉素的降解變化不大,兩者降解率僅相差1.62%；外加1%的碳氮源,葡萄糖和牛肉膏抑制卡那霉素降解,蛋白胨對降解率基本無影響、酵母膏對降解率有促進(jìn)作用。5.分別比較降解菌A2發(fā)酵液、胞內(nèi)酶液、胞外酶液以及細(xì)胞碎片懸浮液對卡那霉素降解能力,表明降解組分屬于胞內(nèi)酶,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該酶為組成型酶；通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化胞內(nèi)酶提取條件,確定最佳條件：超聲破碎功率300 W、頻率超聲2s間隔2s、時(shí)間20 min；該酶適合降解條件為pH4.5-6.5,35℃; 0.1 mM的Fe3+對酶活有促進(jìn)作用,Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+和Cu2+對酶活有顯著的抑制作用,Cu2+抑制作用最大；通過不同底物濃度酶促降解特性結(jié)合米氏方程求得該酶的米氏常數(shù)為371.65 mg/L;6.發(fā)酵菌渣替代氮源實(shí)驗(yàn)表明,菌渣完全替代卡那霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中的黃豆餅粉效果不佳,即使經(jīng)過NaOH改性,僅有50%的效價(jià)；菌渣部分替代黃豆餅粉效果則非常顯著,菌渣添加量0.5%～2.5%(替代原發(fā)酵培養(yǎng)基中14.28%～71.43%的黃豆餅粉)均都能超過90%以上原效價(jià)；新鮮菌渣與發(fā)酵菌渣混合發(fā)酵,混合比1：1能獲得良好的改性效果,替代57.14%的黃豆餅粉發(fā)酵效果達(dá)到90%以上。7.本文還研究了利用乙烯亞胺誘變卡那鏈霉菌獲取高產(chǎn)菌株,最終獲得三株產(chǎn)量較高的菌株,經(jīng)過2代傳代,發(fā)現(xiàn)菌株有所退化,其中菌株Y9效價(jià)較高,比原始菌株提高13%。
【學(xué)位單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：X172;X787
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
中文文摘
緒論
    1.1 氨基糖苷類抗生素介紹
    1.2 抗生素存在問題
    1.3 抗生素殘留的無害化處理手段
        1.3.1 高溫降解法
        1.3.2 化學(xué)處理
        1.3.3 生物法
        1.3.4 酶法降解
    1.4 抗生素廢菌渣的再利用研究進(jìn)展
        1.4.1 抗生素菌渣的理化特點(diǎn)
        1.4.2 抗生素菌渣資源化再利用
    1.5 微生物育種
        1.5.1 傳統(tǒng)誘變育種
        1.5.2 基因工程育種
        1.5.3 基因組改組技術(shù)
        1.5.4 代謝工程育種
    1.6 研究內(nèi)容和意義
        1.6.1 研究內(nèi)容
        1.6.2 研究意義
第一章 卡那霉素降解菌分離鑒定
    1.1 前言
    1.2 材料和方法
        1.2.1 材料
        1.2.2 方法
    1.3 結(jié)果與分析
        1.3.1 卡那霉素降解菌初篩及分離純化
        1.3.2 復(fù)篩
        1.3.3 比較降解菌A1、A2、A3和A4對卡那霉素的降解能力
        1.3.4 降解菌A2菌株的生化鑒定
        1.3.5 降解菌A1、A2和A3的16sDNA鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹
    1.4 小結(jié)與討論
第二章 高效降解菌A2的生長以及降解特性研究
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 繪制卡那霉素降解菌A2生長曲線
        2.3.2 不同濃度的卡那霉素下,降解菌A2的生長動(dòng)力學(xué)變化
        2.3.3 不同pH對降解菌A2生長的影響
        2.3.4 不同溫度對菌株生長的影響
        2.3.5 添加不同金屬離子對A2菌株的生長的影響
        2.3.6 降解菌A2對卡那霉素的耐受能力
        2.3.7 降解菌A2對鏈霉素、慶大霉素的抗性
        2.3.8 溫度對降解菌A2降解能力的影響
        2.3.9 外加0.2%的碳氮源對降解菌A2降解能力的影響
2+對降解菌A2生長的影響'>        2.3.10 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中Mg²⁺對降解菌A2生長的影響
        2.3.11 不同金屬離子對降解菌A2降解能力的影響
    2.4 小結(jié)與討論
第三章 降解菌A2處理卡那霉素發(fā)酵廢渣和廢液
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 降解菌A2處理卡那霉素廢液效果研究
        3.3.2 培養(yǎng)時(shí)間對菌渣中卡那霉素降解效果
        3.3.3 不同接菌量對菌渣中卡那霉素降解的影響
        3.3.4 不同加水量對降解效果的影響
        3.3.5 外加碳氮源對降解菌A2降解菌渣中卡那霉素的影響
    3.4 小結(jié)與討論
第四章 降解酶酶學(xué)性質(zhì)研究
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 降解酶的定位及判斷該酶屬于誘導(dǎo)酶還是組成酶
        4.3.2 不同超聲功率對胞內(nèi)酶活性的影響
        4.3.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化胞內(nèi)粗酶液的超聲破碎提取條件
        4.3.4 不同溫度對降解酶活性的影響
        4.3.5 不同pH對降解酶活性的影響
        4.3.6 卡那霉素降解菌酶促降解動(dòng)力學(xué)曲線
        4.3.7 降解酶對不同濃度底物的酶促降解特性及米氏常數(shù)的確定
        4.3.8 不同金屬離子對酶活的影響
    4.4 小結(jié)與討論
第五章 卡那霉素發(fā)酵菌渣重新用做氮源的再利用研究
    5.1 前言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 方法
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 菌渣理化特性
        5.3.2 菌渣A完全取代培養(yǎng)基中的黃豆餅粉
        5.3.3 比較不同方式預(yù)處理的菌渣以3.5%加量完全替代黃豆餅粉效果
        5.3.4 用NaOH預(yù)處理菌渣完全替代黃豆餅粉的添加量優(yōu)化
        5.3.5 菌渣部分替代培養(yǎng)基中的黃豆餅粉效果研究
        5.3.6 對比NaOH處理菌渣與未處理菌渣以2%的添加量部分替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的黃豆餅粉效果
        5.3.7 發(fā)酵菌渣和新鮮菌渣混合發(fā)酵效果研究
    5.4 小結(jié)與討論
第六章 卡那鏈霉菌的誘變育種
    6.1 前言
    6.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.2.2 方法
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 乙烯亞胺致死曲線
        6.3.2 0.12%乙烯亞胺誘變育種
        6.3.3 研究相對高產(chǎn)菌株編Y9,Y23,Y26的傳代穩(wěn)定性
    6.4 小結(jié)與討論
第七章 結(jié)論與展望
    7.1 研究結(jié)論
    7.2 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果
致謝
個(gè)人簡歷

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2839959