目的:Lhx8基因?qū)τ谀憠A能和GABA能神經(jīng)元的發(fā)生分化發(fā)育有重要作用,但其在新生鼠神經(jīng)元發(fā)育中的作用尚不明確,尤其是Lhx8基因?qū)τ贕ABA能神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用尚未得到一致的認同,基于此,本實驗采用包含有Tet-on系統(tǒng)的慢病毒來調(diào)控Lhx8的表達,研究過表達Lhx8對于新生大鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元的影響。方法:從Gene Bank中調(diào)取Rattus norvegicus Lhx8(rLhx8)序列,上游加入Kozak序列,人工合成全序列,鏈接入pLVX-Tight-IRES-Zs Green-Neo質(zhì)粒產(chǎn)生載體質(zhì)粒pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo,對獲得的質(zhì)粒進行鑒定和擴增;使用293T細胞進行慢病毒包裝,并使用293T細胞檢測其感染能力;將獲得的含有大鼠Lhx8(rLhx8)的慢病毒及其相應(yīng)對照慢病毒對新生大鼠進行腦室注射,給予0.5mg/ml四環(huán)素誘導(dǎo)rLhx8的表達,在注射病毒48h,72h和96h后,每只新生大鼠取左側(cè)海馬提取RNA,右側(cè)海馬提取蛋白質(zhì),通過RT-PCR和Western blot檢測新生大鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元表面標志物(Choline Acetyltransferase,CHAT)和GABA能神經(jīng)元表面標志物(Glutamic Acid Decarboxylases 65,GAD65)表達的變化,取全腦制備石蠟切片,利用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測CHAT和GAD65的表達,利用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果,每只大鼠選擇4張切片,每張切片選擇4個視野觀察拍照,所獲得的圖片經(jīng)過Ipwin檢測平均熒光密度,取平均值,經(jīng)過Graphpad來對各組數(shù)據(jù)進行平均值和方差計算,組間比較使用t檢驗,P0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:包裝質(zhì)粒(pLP1,pLP2和pLP/VSVG)、載體質(zhì)粒(pLVX-Tight-IRES-Zs Green-Neo和pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo)和調(diào)控質(zhì)粒(pLVX-Tet-On-Puro)鑒定成功后,對其進行擴增,通過大提試劑盒可得到滿足實驗需求的質(zhì)粒。pLP1,pLP2,pLP/VSVG,pLVX-Tet-On-Puro和pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo五質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,可見綠色熒光,收集上清,離心沉淀獲得慢病毒,同時用其感染293T細胞,表明慢病毒具有感染能力。RT-PCR結(jié)果表明,誘導(dǎo)Lhx8基因過表達48h時,各組間檢測指標無差異;72h及96h時,膽堿能神經(jīng)元表面標志物CHAT增加,GABA能神經(jīng)元表面標志物GAD65減少(P0.05,n=4),有統(tǒng)計學(xué)意義。新生大鼠海馬免疫熒光染色結(jié)果表明,慢病毒載體介導(dǎo)的外源Lxh8基因的過表達,使新生大鼠海馬CHAT陽性表達細胞數(shù)增加,使GAD65陽性表達細胞數(shù)減少,(P0.05,n=4),有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot結(jié)果表明,慢病毒注射四環(huán)素誘導(dǎo)48h時,實驗組各組間沒有差異,72h及96h時,GAD65的蛋白翻譯水平有降低,(P0.05,n=4),有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:在新生大鼠海馬部,誘導(dǎo)Lhx8基因過表達72h及96h后能夠促進膽堿能神經(jīng)元的標志物CHAT表達,抑制GABA能神經(jīng)元表面標志物GAD65的表達。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R338
【文章目錄】：
前言
摘要
Abstract
英文縮略詞
第1章 文獻綜述
第2章 材料與方法
    2.1 實驗試劑
    2.2 實驗儀器
    2.3 實驗細胞及動物
        2.3.1 實驗細胞
        2.3.2 實驗動物
    2.4 實驗試劑配制
    2.5 實驗方法
        2.5.1 質(zhì)粒的獲得、鑒定及擴增
        2.5.2 293T細胞培養(yǎng)
        2.5.3 慢病毒包裝
        2.5.4 新生大鼠慢病毒腦室注射及取材
        2.5.5 RT-PCR技術(shù)檢測慢病毒注射后新生大鼠海馬膽堿能及GABA能神經(jīng)元的表達水平
        2.5.6 Western Blot技術(shù)檢測慢病毒毒注射后新生大鼠海馬GABA能神經(jīng)元的蛋白表達水平
        2.5.7 CHAT及GAD65的免疫熒光染色
    2.6 統(tǒng)計學(xué)分析
第3章 實驗結(jié)果
    3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建擴增及鑒定
        3.1.1 pLVX-Tight-rLhx8-IRES-ZsGreen-Neo質(zhì)粒構(gòu)建
        3.1.2 pLP1，pLP/VSVG及pLVX-Tight-IRES-ZsGreen-Neo質(zhì)粒圖譜及鑒定
        3.1.3 pLP2質(zhì)粒圖譜及鑒定
        3.1.4 pLVX-Tight-rLhx8-IRES-ZsGreen-Neo和pLVX--Tet-On-Puro質(zhì)粒圖譜及鑒定
    3.2 慢病毒包裝
    3.3 新生大鼠側(cè)腦室注射
    3.4 RT-PCR檢測組織中rLhx8、GAD65和CHAT的表達情況
    3.5 各組海馬組織中CHAT和GAD65的免疫熒光檢測結(jié)果
    3.6 Western blot檢測各組組織中GAD65的表達情況
第4章 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻
研究生期間所取得的科研成果
致謝

【參考文獻】

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