【摘要】：野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的致病菌。Xcc能夠在世界范圍內(nèi)感染十字花科植物,從而在種植此類作物的地區(qū)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是一種較為罕見的革蘭氏陰性條件致病菌,易引起免疫力低下個體出現(xiàn)感染癥狀。c-di-GMP是一種廣為人知的胞內(nèi)第二信使,參與細(xì)菌包括生物被膜合成、細(xì)菌毒力、細(xì)胞運(yùn)動等多種重要生理功能。而c-di-GMP的功能是通過細(xì)胞內(nèi)存在的c-di-GMP受體實(shí)現(xiàn)的。c-di-GMP通過與受體相互作用而引起下游相應(yīng)生理生化功能變化從而行使其功能。近期有研究報道YajQ蛋白家族成員中存在一種新型的c-di-GMP受體。YajQ家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在細(xì)菌中相對保守,具有潛在的與核酸結(jié)合的能力。而Xcc中的YajQ家族成員XC3703被證明能與轉(zhuǎn)錄因子XC2801發(fā)生相互作用,而其與c-di-GMP的結(jié)合能夠逆轉(zhuǎn)這種相互作用,從而影響下游基因的表達(dá),影響包括生物被膜形成、細(xì)菌毒力等在內(nèi)的多種重要生物學(xué)功能。而S.maltophilia中的同家族成員Smlt4090被證明也有結(jié)合c-di-GMP的能力,該蛋白的突變菌株生物被膜形成量及對侵染對象的吸附性明顯降低。在本論文的第一部分中,主要內(nèi)容為XC3703及Smlt4090結(jié)構(gòu)與功能的研究。XC3703及Smlt4090氨基酸序列比對相似度高達(dá)83%。在此論文中,我們成功解析得到了 XC3703及Smlt4090的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),但是遺憾的是并未獲得二者與c-di-GMP形成的復(fù)合物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。在解析獲得的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中,XC3703每個不對稱單位中包含兩個蛋白質(zhì)分子,但隨后的分析柱實(shí)驗(yàn)證明其在溶液狀態(tài)中以單體形式存在。而在Smlt4090結(jié)構(gòu)中,每個不對稱單位中包含三個蛋白質(zhì)分子,分析柱實(shí)驗(yàn)同樣證明其在溶液狀態(tài)中以單體形式存在。另外,結(jié)構(gòu)比對結(jié)果顯示,二者結(jié)構(gòu)相似度高達(dá)81%,根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)是引發(fā)植物冠癭病的病原菌,能夠使植物形成冠癭瘤。另外,由于該菌基因組中的Ti質(zhì)粒,其在植物遺傳操作中有重要應(yīng)用。細(xì)菌六型分泌系統(tǒng)(Type Ⅳ secretion system,T6SS)是近年來備受關(guān)注的一種細(xì)菌分泌系統(tǒng)。T6SS是一種功能與結(jié)構(gòu)上皆類似于倒置的噬菌體尾部的注射器狀分泌裝置,能夠通過將多種效應(yīng)蛋白注射至相鄰原核或真核細(xì)胞中取得競爭或生存優(yōu)勢。而近期的實(shí)驗(yàn)證明,效應(yīng)蛋白的有效輸出需要同宗銜接蛋白的參與。銜接蛋白能與相應(yīng)效應(yīng)蛋白及注射裝置組成部分VgrG蛋白形成復(fù)合物,從而幫助效應(yīng)蛋白分泌。銜接蛋白基因敲除后細(xì)菌毒力明顯下降。在本論文的第二部分中,主要內(nèi)容為根癌土壤桿菌中銜接蛋白Tap-1蛋白質(zhì)純化及結(jié)晶條件的研究。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),使用大腸桿菌BL21細(xì)胞表達(dá)得到的Tap-1蛋白無法得到蛋白晶體�？紤]到Tap-1中有三個半胱氨酸,晶體生長可能受二硫鍵影響。因此在實(shí)驗(yàn)中除片段截取外還嘗試了其他的三種方法:一為在氧化型菌株大腸桿菌TransB菌株中表達(dá)蛋白,幫助二硫鍵正確形成;二為在純化過程中添加還原劑DTT防止二硫鍵形成;三為對蛋白質(zhì)進(jìn)行限制性酶切,截取核心部分進(jìn)行晶體生長。方法一、二均得到蛋白晶體,晶體外觀較好,但衍射質(zhì)量尚達(dá)不到解析要求,需進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S432.4

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本文編號：2745767