發(fā)布時(shí)間：2020-07-08 06:18

【摘要】：藍(lán)藻毒素MC-LR可對人和動(dòng)物產(chǎn)生生物毒性,近年來為毒理學(xué)研究者所關(guān)注。但MC-LR的肝毒性機(jī)制尚不完全清楚,特別是對白鰱肝損傷機(jī)制鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用第二代轉(zhuǎn)錄組測序方法,較為全面系統(tǒng)地解析MC-LR暴露導(dǎo)致白鰱肝毒性的分子機(jī)制,為全面和深入理解MC-LR對魚類肝毒性的機(jī)制提供理論支撐。本實(shí)驗(yàn)以白鰱為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過改良寇氏法獲得MC-LR對白鰱急性毒性的24 h半致死劑量LD_(50)(544μg/kg)。依據(jù)所獲得的LD_(50),選定高濃度組(200μg/kg)、低濃度組(50μg/kg)及對照組(8.6%生理鹽水)對白鰱進(jìn)行腹腔注射急性染毒實(shí)驗(yàn)。通過提取處理組和對照組的白鰱肝臟總RNA,應(yīng)用Illumina Hiseq 4000平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,采用無參考序列的De novo組裝,處理組和對照組共產(chǎn)生了超過20 Gb的數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)分別對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選、GO功能分析、KEGG pathway分析,并對差異表達(dá)基因進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證,獲得以下幾個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.De novo測序結(jié)果腹腔注射50μg/kg和200μg/kg MC-LR處理組和對照組分別獲得轉(zhuǎn)錄本的總長度為54 217 023 bp、66 980 128 bp、53 611 308 bp;平均長度分別為779 bp、830 bp、790 bp;長度多集中在200-400 bp,以300 bp長度為主,說明樣品片段斷裂隨機(jī)性強(qiáng),符合組裝要求。轉(zhuǎn)錄本組裝后共得到Unigene數(shù)目分別為50 116個(gè)、58 987個(gè)、49 383個(gè)。將這些轉(zhuǎn)錄本使用Trinity組裝后得到的Unigene,采用了RPKM方法計(jì)算各個(gè)基因表達(dá)量。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),50μg/kg MC-LR處理組與對照組相比共有上調(diào)基因2 565個(gè)、下調(diào)1 831個(gè);200μg/kg MC-LR處理組與對照組相比共有上調(diào)基因7 256個(gè)、下調(diào)4 751個(gè)。2.差異表達(dá)基因的GO功能分析將差異表達(dá)基因逐一在GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析,注釋比對基因的功能以及參與的生物過程。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),GO重疊群分布在斑馬魚和草魚之間。在GO數(shù)據(jù)庫共注釋了14 268個(gè)差異表達(dá)基因,覆蓋率分別為20.67%。MC-LR暴露后在白鰱肝臟中差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞器、核質(zhì)、細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物、細(xì)胞連接等部分,可能影響受體活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、酶調(diào)節(jié)劑活性、氧化還原過程、有機(jī)酸代謝、有機(jī)氮化合物代謝、輔酶因子代謝、DNA損傷修復(fù)等過程。主要參與應(yīng)激反應(yīng)、生殖發(fā)育、生物調(diào)節(jié)、氧化還原、代謝過程、激素分泌、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生、細(xì)胞聚集、細(xì)胞粘附等過程。3.差異表達(dá)基因的KEGG pathway分析分析結(jié)果顯示,在KEGG數(shù)據(jù)庫中對比到31 890個(gè)Unigene,覆蓋率46.19%。通過差異表達(dá)基因在KEGG pathway富集發(fā)現(xiàn),MC-LR毒性作用機(jī)制可能涉及到NF-κB信號通路、p53信號通路、磷脂酰肌醇3信號通路、Wnt信號通路等。4.qPCR驗(yàn)證主要的差異表達(dá)基因根據(jù)差異基因表達(dá)量、GO分析以及KEGG pathway分析結(jié)果,對篩選到的主要差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示MC-LR處理組中Raf1、CDC42/RAS、ERK、c-jun、c-myc、p53、S6K1/2、SOS、PTEN、AKT、IKKα、IKKβ、caspase-8、bax、p21、SHP、RAC、PP2A基因表達(dá)上調(diào),與轉(zhuǎn)錄組預(yù)測結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法較為全面地解析了MCs對白鰱肝毒性作用的主要分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了一些與MCs肝毒性相關(guān)新的信號通路。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅有助于發(fā)現(xiàn)魚類肝病防治的藥物靶點(diǎn),同時(shí)也為人類肝炎、肝癌預(yù)防和尋找MCs肝毒性新的分子標(biāo)記物提供重要的理論支撐。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：X52;X171.5;S943
【圖文】：

1.2.1 MCs 的結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)上，MCs 屬于環(huán)七肽類的小分子，分子量在 800 到 1 100 Da 之間, 要在肝臟中富集而被公認(rèn)為非核糖體肝毒素。微囊藻毒素的一般結(jié)構(gòu)中包含7個(gè)氨具有 2 個(gè)末端氨基酸。目前統(tǒng)計(jì)共有 100 多種亞型，其中毒性最強(qiáng)的當(dāng)屬微囊藻毒(Microcystin-LR, MC-LR)，常見的主要有 MC-LR、微囊藻毒素-RR (MicrocysMC-RR ) 和微囊藻毒素-YR (Microcystin-YR, MC-YR) 3 類[27]，其亞型由位于 R1可 變 氨 基 酸 變 化 而 產(chǎn) 生 （ 如 圖 1-1 ）。 大 多 數(shù) 同 類 物 的 通 式 結(jié) 構(gòu) 為 （D-alanine1-X2-D-MeAsp3-Z4 -Adda5-D-glutamate6-Mdha7），其中最具特殊性的Adda (3-amino-9-methoxy-2, 4, 6-trimethyl -10- phenyldeca -4, 6- dienoic acid)，被MCs 產(chǎn)生毒性表達(dá)所必需的氨基酸[28]。一旦切斷 Adda 肽環(huán)側(cè)鏈，便不能抑制子蛋白磷酸酶的活性，即微囊藻毒性失活[29]；且有研究指出通式結(jié)構(gòu)中 D-glutam基酸在微囊藻毒素的肝毒性中可能起著非常重要的作用[30]。

與 12 年鉛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相比[129]，后者的轉(zhuǎn)錄組顯示更少但更長的轉(zhuǎn)錄本。這原因可能是前者是由多個(gè)器官的混合文庫組成，比肝臟轉(zhuǎn)錄物更多的器官特異；另一個(gè)原因可能是由于技術(shù)相對成熟，測序深度更加理想。對于非模式動(dòng)物來ovo 測序技術(shù)（如圖 1-1）能夠從頭測序，不需要任何基因序列信息即可對某行測序，然后用生物信息學(xué)的分析方法對序列進(jìn)行拼接、組裝，從而獲得該物組序列圖譜。目前尚未報(bào)道有關(guān) MC-LR 對白鰱肝毒性的轉(zhuǎn)錄組分析，因此本用 De novo 測序技術(shù)更好地理解 MC-LR 對白鰱肝臟的毒性機(jī)制。

圖 2-1 信息分析流程圖Fig. 2-1 The flow chart of information analysis2.2.4 原始數(shù)據(jù)的過濾最初獲取到的原始數(shù)據(jù)被稱為 Raw reads, 這些數(shù)據(jù)必須再次經(jīng)過過濾處理，去掉質(zhì)量 （自定義長度㩳15 個(gè)堿基且占該 reads 總體堿基數(shù)目的比例㧐20% 的 reads頭被污染以及堿基 N 含量過高的 reads（自定義㧐5% 的 reads），才能得到高質(zhì)量據(jù)，稱為 Clean reads。將 Clean reads 保存為 FASTQ 格式用于后續(xù)操作。使用 Trinity 法對 Clean reads 進(jìn)行 De novo 組裝。Trinity 的方法主要是通過nchworm、Chrysalis 和 Butterfly 三個(gè)獨(dú)立模塊按照順序以此對 Clean reads 進(jìn)行處表 2-6。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2746195