【摘要】：藍藻毒素MC-LR可對人和動物產生生物毒性,近年來為毒理學研究者所關注。但MC-LR的肝毒性機制尚不完全清楚,特別是對白鰱肝損傷機制鮮有報道。本實驗采用第二代轉錄組測序方法,較為全面系統(tǒng)地解析MC-LR暴露導致白鰱肝毒性的分子機制,為全面和深入理解MC-LR對魚類肝毒性的機制提供理論支撐。本實驗以白鰱為實驗動物,通過改良寇氏法獲得MC-LR對白鰱急性毒性的24 h半致死劑量LD_(50)(544μg/kg)。依據所獲得的LD_(50),選定高濃度組(200μg/kg)、低濃度組(50μg/kg)及對照組(8.6%生理鹽水)對白鰱進行腹腔注射急性染毒實驗。通過提取處理組和對照組的白鰱肝臟總RNA,應用Illumina Hiseq 4000平臺進行轉錄組測序,采用無參考序列的De novo組裝,處理組和對照組共產生了超過20 Gb的數據。本實驗分別對轉錄組數據進行差異表達基因的篩選、GO功能分析、KEGG pathway分析,并對差異表達基因進行了qPCR驗證,獲得以下幾個方面的實驗結果。1.De novo測序結果腹腔注射50μg/kg和200μg/kg MC-LR處理組和對照組分別獲得轉錄本的總長度為54 217 023 bp、66 980 128 bp、53 611 308 bp;平均長度分別為779 bp、830 bp、790 bp;長度多集中在200-400 bp,以300 bp長度為主,說明樣品片段斷裂隨機性強,符合組裝要求。轉錄本組裝后共得到Unigene數目分別為50 116個、58 987個、49 383個。將這些轉錄本使用Trinity組裝后得到的Unigene,采用了RPKM方法計算各個基因表達量。根據統(tǒng)計學差異標準,結果發(fā)現,50μg/kg MC-LR處理組與對照組相比共有上調基因2 565個、下調1 831個;200μg/kg MC-LR處理組與對照組相比共有上調基因7 256個、下調4 751個。2.差異表達基因的GO功能分析將差異表達基因逐一在GO數據庫進行比對分析,注釋比對基因的功能以及參與的生物過程。分析結果發(fā)現,GO重疊群分布在斑馬魚和草魚之間。在GO數據庫共注釋了14 268個差異表達基因,覆蓋率分別為20.67%。MC-LR暴露后在白鰱肝臟中差異表達基因主要富集在細胞器、核質、細胞膜、大分子復合物、細胞連接等部分,可能影響受體活性、蛋白結合轉錄因子活性、核酸結合轉錄因子活性、分子轉導活性、酶調節(jié)劑活性、氧化還原過程、有機酸代謝、有機氮化合物代謝、輔酶因子代謝、DNA損傷修復等過程。主要參與應激反應、生殖發(fā)育、生物調節(jié)、氧化還原、代謝過程、激素分泌、免疫系統(tǒng)、細胞組分組織或生物發(fā)生、細胞聚集、細胞粘附等過程。3.差異表達基因的KEGG pathway分析分析結果顯示,在KEGG數據庫中對比到31 890個Unigene,覆蓋率46.19%。通過差異表達基因在KEGG pathway富集發(fā)現,MC-LR毒性作用機制可能涉及到NF-κB信號通路、p53信號通路、磷脂酰肌醇3信號通路、Wnt信號通路等。4.qPCR驗證主要的差異表達基因根據差異基因表達量、GO分析以及KEGG pathway分析結果,對篩選到的主要差異表達基因進行熒光定量PCR驗證。結果顯示MC-LR處理組中Raf1、CDC42/RAS、ERK、c-jun、c-myc、p53、S6K1/2、SOS、PTEN、AKT、IKKα、IKKβ、caspase-8、bax、p21、SHP、RAC、PP2A基因表達上調,與轉錄組預測結果一致。本實驗通過轉錄組學方法較為全面地解析了MCs對白鰱肝毒性作用的主要分子機制,發(fā)現了一些與MCs肝毒性相關新的信號通路。該實驗結果不僅有助于發(fā)現魚類肝病防治的藥物靶點,同時也為人類肝炎、肝癌預防和尋找MCs肝毒性新的分子標記物提供重要的理論支撐。
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X52;X171.5;S943
【圖文】：

1.2.1 MCs 的結構在結構上，MCs 屬于環(huán)七肽類的小分子，分子量在 800 到 1 100 Da 之間, 要在肝臟中富集而被公認為非核糖體肝毒素。微囊藻毒素的一般結構中包含7個氨具有 2 個末端氨基酸。目前統(tǒng)計共有 100 多種亞型，其中毒性最強的當屬微囊藻毒(Microcystin-LR, MC-LR)，常見的主要有 MC-LR、微囊藻毒素-RR (MicrocysMC-RR ) 和微囊藻毒素-YR (Microcystin-YR, MC-YR) 3 類[27]，其亞型由位于 R1可 變 氨 基 酸 變 化 而 產 生 （ 如 圖 1-1 ）。 大 多 數 同 類 物 的 通 式 結 構 為 （D-alanine1-X2-D-MeAsp3-Z4 -Adda5-D-glutamate6-Mdha7），其中最具特殊性的Adda (3-amino-9-methoxy-2, 4, 6-trimethyl -10- phenyldeca -4, 6- dienoic acid)，被MCs 產生毒性表達所必需的氨基酸[28]。一旦切斷 Adda 肽環(huán)側鏈，便不能抑制子蛋白磷酸酶的活性，即微囊藻毒性失活[29]；且有研究指出通式結構中 D-glutam基酸在微囊藻毒素的肝毒性中可能起著非常重要的作用[30]。

與 12 年鉛轉錄組數據相比[129]，后者的轉錄組顯示更少但更長的轉錄本。這原因可能是前者是由多個器官的混合文庫組成，比肝臟轉錄物更多的器官特異；另一個原因可能是由于技術相對成熟，測序深度更加理想。對于非模式動物來ovo 測序技術（如圖 1-1）能夠從頭測序，不需要任何基因序列信息即可對某行測序，然后用生物信息學的分析方法對序列進行拼接、組裝，從而獲得該物組序列圖譜。目前尚未報道有關 MC-LR 對白鰱肝毒性的轉錄組分析，因此本用 De novo 測序技術更好地理解 MC-LR 對白鰱肝臟的毒性機制。

圖 2-1 信息分析流程圖Fig. 2-1 The flow chart of information analysis2.2.4 原始數據的過濾最初獲取到的原始數據被稱為 Raw reads, 這些數據必須再次經過過濾處理，去掉質量 （自定義長度㩳15 個堿基且占該 reads 總體堿基數目的比例㧐20% 的 reads頭被污染以及堿基 N 含量過高的 reads（自定義㧐5% 的 reads），才能得到高質量據，稱為 Clean reads。將 Clean reads 保存為 FASTQ 格式用于后續(xù)操作。使用 Trinity 法對 Clean reads 進行 De novo 組裝。Trinity 的方法主要是通過nchworm、Chrysalis 和 Butterfly 三個獨立模塊按照順序以此對 Clean reads 進行處表 2-6。

【參考文獻】

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本文編號：2746195