【摘要】：家蠶(Bombyx mori)因其絲腺能夠合成蠶絲而成為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,也作為鱗翅目昆蟲的典型代表而成為變態(tài)和發(fā)育生物學(xué)研究的模式昆蟲。后部絲腺(PSG)負(fù)責(zé)分泌合成絲素蛋白,而絲素蛋白是蠶絲蛋白的主效成分,直接決定著蠶絲蛋白的質(zhì)量和產(chǎn)量。對家蠶絲素蛋白合成調(diào)控機(jī)制的闡明,將為今后蠶業(yè)分子育種提供重要的理論參考。家蠶絲腺轉(zhuǎn)錄因子SGF1(Silk Gland Factor 1)屬于FOXA轉(zhuǎn)錄因子家族,是家蠶中首個(gè)被報(bào)道參與調(diào)控絲素蛋白轉(zhuǎn)錄的重要因子。合作實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),Ras1cA轉(zhuǎn)基因家蠶后部絲腺中SGF1肽段(EQEAAS*PTSALQR)的磷酸化水平升高,推測磷酸化升高的SGF1與轉(zhuǎn)基因家蠶蠶絲產(chǎn)量升高相關(guān),而SGF1磷酸化水平變化如何影響其對絲素蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,且在該過程中如何受到Ras1下游Raf/MAPK或PI3K/AKT信號通路的調(diào)控,還有待探究。本研究運(yùn)用生物信息軟件對家蠶SGF1基因進(jìn)行分析,并對SGF1肽段(EQEAAS*PTSALQR)的位點(diǎn)和調(diào)控的激酶進(jìn)行預(yù)測;對制備的SGF1全長和磷酸化抗體進(jìn)行體外驗(yàn)證和體內(nèi)的PSG發(fā)育表達(dá)譜分析;運(yùn)用Western blot和免疫熒光染色方法在體內(nèi)初步明確SGF1的核定位與其調(diào)控絲素蛋白基因的功能呈正相關(guān);利用Raf/MAPK或PI3K/AKT信號通路抑制劑對蟲體進(jìn)行處理以明確哪條信號通路對SGF1核定位起到主要作用;最終在家蠶和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中進(jìn)一步研究了 Raf/MAPK或PI3K/AKT抑制劑對SGF1和SGF1同源基因FoxA1核定位的影響是否通過磷酸化調(diào)控的方式實(shí)現(xiàn)。主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1.全長和磷酸化SGF1抗體的驗(yàn)證及SGF1在家蠶后部絲腺中的表達(dá)譜分析根據(jù)已知的SGF1全長和磷酸化肽段序列信息,制備全長和磷酸化抗體。構(gòu)建pIEx4-SGF1-V5和pIEx4-SGF1s91A-V5兩種質(zhì)粒,在家蠶BmN細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染并進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證。隨后,對家蠶后部絲腺SGF1基因時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)從4齡第4天(4L4D)開始一直到5齡第3天(5L3D),SGF1的轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加,隨后開始逐漸降低,對家蠶后部絲腺SGF1蛋白表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)從4齡第4天(4L4D)開始一直到5齡第7天(5L7D),其蛋白表達(dá)水平逐漸增加,而從5L7D開始,其蛋白表達(dá)水平迅速下降。2.家蠶體內(nèi)SGF1的核定位與其絲素蛋白表達(dá)調(diào)控的相關(guān)性分析利用免疫熒光染色方法對SGF1在家蠶后部絲腺不同發(fā)育階段的定位進(jìn)行檢測,結(jié)果表明在家蠶攝食期,SGF1普遍存在核定位現(xiàn)象。即在預(yù)蛹1天(PP1)之前SGF1 一直位于細(xì)胞核內(nèi),而在預(yù)蛹2天(PP2)時(shí)SGF1位于細(xì)胞核外,因此從PP1到PP2的過程中SGF1核定位發(fā)生改變,即由原來SGF1聚集在核內(nèi)變化為彌散在核外。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以確證SGF1出核的時(shí)間窗口,發(fā)現(xiàn)其具體出核時(shí)間為上簇36h(W36h)。利用免疫熒光染色方法和Western Blot比較W36h時(shí)期Ras1CA轉(zhuǎn)基因家蠶和野生型家蠶中SGF1定位和表達(dá),發(fā)現(xiàn)與野生型家蠶相比,轉(zhuǎn)基因家蠶的SGF1依舊定位在細(xì)胞核中且蛋白表達(dá)量較高。3.體內(nèi)研究Raf/MAPK或PI3K/AKT通路對SGF1核定位的影響為分析Ras下游Raf/MAPK或PI3K/AKT通路如何影響SGF1的表達(dá)和定位。本研究采用Raf/MAPK抑制劑為PLX和PD60,PI3K/AKT/TORC1的抑制劑為Wort、Rapa和LY294。在家蠶蟲體水平進(jìn)行抑制劑處理,經(jīng)免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,處理后的SGF1表達(dá)量減少并且不在核內(nèi),因此說明這兩種信號通路參與調(diào)控其核定位過程。4.體外研究Raf/MAPK或PI3K/AKT通路對SGF1核定位的影響在BrnN細(xì)胞中通過抑制劑處理和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Raf/MAPK或PI3K/AKT通路通過調(diào)控SGF1 Ser91位點(diǎn)影響其核定位功能。為明晰該調(diào)控機(jī)制是否存在進(jìn)化上的保守性,構(gòu)建SGF1的同源基因FoxA1的野生型和點(diǎn)突變載體,利用免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)和Western Blot研究FoxA1的可能磷酸化位點(diǎn)以及所受信號通路調(diào)控,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoxA1磷酸化位點(diǎn)與核定位無關(guān),但其核定位功能受Raf/MAPK信號通路調(diào)控。綜上所述,家蠶后部絲腺中的SGF1核定位受到Raf/MAPK和PI3K/AKT/TORC1信號通路的調(diào)控,且與SGF1對絲素蛋白合成調(diào)控正相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q963

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 赤井弘;崔立旺;;家蠶絲腺細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及其功能[J];國外農(nóng)學(xué)-蠶業(yè);1986年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 趙小明;家蠶絲腺特異表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage和Bmdimm的功能研究[D];西南大學(xué);2014年

，

本文編號：2572410