【摘要】：β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)是一種纖維素酶,它可以在纖維素的代謝反應(yīng)中起作用,將纖維二糖分解為更容易被利用的葡萄糖,它還可以將水果和茶葉中的香氣前體物質(zhì)進(jìn)行酶解,從而起到增香的作用。β-葡萄糖苷酶在食品、日用化工、可再生資源等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但是在實(shí)際應(yīng)用中還是有許多不足,例如酶成本不夠低廉,在工業(yè)應(yīng)用中,酶不能很好的適應(yīng)工業(yè)環(huán)境,穩(wěn)定性不夠好等,這些因素都會(huì)限制β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用。因此,對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行改造具有十分重要的意義。本研究對(duì)來(lái)源于Thermobifida fusca的β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行了克隆,成功構(gòu)建了mEsprit-Bglc-His質(zhì)粒,并對(duì)其表達(dá)的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了一些理化性質(zhì)的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明,其相對(duì)分子質(zhì)量約為55 kDa,反應(yīng)時(shí)最適溫度是60℃,最適緩沖液pH是7.0,最適反應(yīng)時(shí)間是30 min,對(duì)底物p-NPG的米氏常數(shù)Km為0.19 mmol/L。該酶的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及儲(chǔ)存穩(wěn)定性都欠佳,因此,本研究對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)和分析,試圖找到提高穩(wěn)定性的辦法。通過(guò)同源比對(duì)找到了它的保守區(qū)序列,選取4個(gè)不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶對(duì)兩個(gè)保守區(qū)之間的序列進(jìn)行了二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析,結(jié)果表明,這一段序列的α-螺旋含量各不相同,脯氨酸數(shù)量和位置也各不相同,對(duì)這一段序列進(jìn)行替換很有可能引入更高含量的α-螺旋和脯氨酸,進(jìn)而提高穩(wěn)定性。本研究對(duì)這兩個(gè)保守區(qū)之間的序列構(gòu)建土壤宏基因組區(qū)段庫(kù),將來(lái)源于T.fusca的β-葡萄糖苷酶基因的這一小段序列,替換成來(lái)源于土壤中其他菌β-葡萄糖苷酶基因的序列,從而構(gòu)建出許多新的β-葡萄糖苷酶基因。盡管通過(guò)篩選,沒(méi)有獲得有應(yīng)用價(jià)值的新的β-葡萄糖苷酶基因,但本研究為高效開(kāi)發(fā)利用微生物基因資源提供了新的思路和方法,對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的研究也有重要的參考價(jià)值。為了進(jìn)一步改善酶學(xué)性質(zhì),本研究還用癸二酸包覆的磁性納米顆粒對(duì)其進(jìn)行了固定化,同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了一些酶學(xué)性質(zhì)的研究,并與游離的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了比較。試驗(yàn)結(jié)果表明,反應(yīng)的最適pH值為7.0,最適溫度為40℃,與游離酶相比,最適溫度降低,發(fā)生了偏移。固定后的酶,循環(huán)使用10次剩余活性仍然在60%以上,對(duì)底物p-NPG的米氏常數(shù)Km為0.28 mmol/L,與游離酶km值相比略增加了一點(diǎn)。本研究用癸二酸包覆的磁性納米顆粒對(duì)其進(jìn)行的固定化,提高了β-葡萄糖苷酶的一些方面的穩(wěn)定性,包括溫度、pH、有機(jī)溶劑、渦旋、超聲以及儲(chǔ)存穩(wěn)定性等,這將大大提高β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用范圍,使其更適合應(yīng)用于工業(yè)。另外本研究還利用固定化β-葡萄糖苷酶重復(fù)分解天然底物稻殼粉和玉米芯粉,這對(duì)合理利用纖維素有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q814.2;Q78

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本文編號(hào)：2572056