【摘要】：一、研究目的及背景肌球蛋白(Myosin)家族屬于馬達蛋白超家族,可以將細(xì)胞內(nèi)的機械能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,進而參與生物體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)超過20種肌球蛋白分子,在結(jié)構(gòu)和功能上具有差異,但都可以通過頭部結(jié)合ATP酶水解ATP沿actin進行移動。目前研究最多是Myosin Ⅱ,即肌球蛋白Ⅱ。Myosin Ⅱ最早在肌肉中被發(fā)現(xiàn),通過水解ATP產(chǎn)生的能量介導(dǎo)肌肉收縮。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)在非肌肉組織,如神經(jīng)元中也存在Myosin Ⅱ的表達,稱為非肌肉型MyosinⅡ(non-muscle myosinⅡ,NMⅡ)。Myosin Ⅱ 是一個六聚體,包含一對高分子量的重鏈(MHC)及結(jié)合在重鏈頸部的兩對小分子量的輕鏈(MLC),其中包含兩條調(diào)節(jié)型輕鏈和兩條必要型輕鏈。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Myosin Ⅱ有較高的表達,并起著重要的調(diào)控作用,主要參與神經(jīng)元的遷移、突起的生長及導(dǎo)向、微管在神經(jīng)元生長錐內(nèi)的狀態(tài)與轉(zhuǎn)運、肌動蛋白(actin)的動態(tài)變化、樹突棘spines的形成等過程。NMⅡ的活性主要受其輕鏈MLC2的激活調(diào)控,參與的激酶主要有肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light chain kinase,MLCK)及Rho亞家族(RhoA)激酶。NMⅡ作為細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)的馬達蛋白也參與到腦的高級功能中。文獻報道Myosin Ⅱ在早期長時程增強(Long Term Potentiation,LTP)的維持過程發(fā)揮作用;并且通過不同信號激活,分別參與到長時程條件性恐懼記憶的整合階段,及緣下回(infralimbic cortex,IL)腦區(qū)味覺厭惡記憶的消退中。目前的報道多以直接干擾重鏈的形成從而影響Myosin Ⅱ功能為主,但是Myosin Ⅱ活性上游受到哪些因素調(diào)控,并沒有詳細(xì)的報道。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是腦中廣泛存在的神經(jīng)營養(yǎng)因子,通過與膜上兩種不同親和力的受體-高親和力酪氨酸激酶受體B(Tropomyosin receptor kinase B,Trk)和低親和力神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(The Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor,P75NTR)結(jié)合,激活下游信號通路。BDNF除了能夠促進神經(jīng)元的存活及分化、突起的生長,還在突觸可塑性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能。突觸的可塑性也被廣泛認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ),調(diào)控神經(jīng)元之間的信息傳遞。在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中,BDNF能夠誘導(dǎo)LTP的產(chǎn)生并維持LTP的穩(wěn)定。BDNF還可以通過調(diào)控肌動蛋白(actin)的動態(tài)變化促進樹突棘的形成。BDNF是否對Myosin II的活性存在調(diào)控作用,具體的信號通路又是什么?本文采用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的多種方法,證實BDNF/TrkB信號通路可以上調(diào)調(diào)節(jié)型輕鏈MLC2的磷酸化水平,從而上調(diào)Myosin II活性。進一步證明這一過程并不依賴TrkB下游經(jīng)典的三條信號通路,而是通過SRC家族的LYN激酶實現(xiàn)的。本研究可更好的幫助我們了解Myosin II的功能及作用機制。二、實驗方法1、構(gòu)建各種小干擾片段。2、特異性MLCK短肽3、海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)染。4、Western Bolt 及 CO-IP三、實驗結(jié)果1、BDNF通過高親和性受體TrkB調(diào)節(jié)MLC2磷酸化。首先通過蛋白免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn),給予體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元BDNF刺激30min時,p-MLC2灰度值較con組明顯增加(p0.05,而且隨時間增加(2h時)灰度值持續(xù)增加(p≤0.01)。在給予BDNF刺激前加入抑制P75NTR功能的短肽(TAT-Pep5)、Trk激酶抑制劑(K252a)預(yù)處理30min,與對照組相比較,K252a+BDNF組p-MLC2灰度值并無明顯增加。同樣的給予老鼠海馬腦區(qū)注射BDNF、K252a結(jié)果發(fā)現(xiàn),BDNF組p-MLC2明顯增加(p0.05)。2、BDNF通過激活MLCK調(diào)控MLC2磷酸化我們發(fā)現(xiàn)分別給予體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元磷酸酶抑制劑(CalA)、ROCK激酶抑制劑(Y27623)、MLCK激酶抑制劑(ML-7)預(yù)處理30min后,BDNF刺激2h,ML-7+BDNF組p-MLC2沒有明顯升高。在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中加入特異性短肽抑制MLCK與MLC2結(jié)合后,BDNF刺激2h,TAT MLCK+BDNF組p-MLC2并無明顯變化。3、SRC通路參與BDNF調(diào)控MLC2磷酸化水平變化之前發(fā)現(xiàn)BDNF對p-MLC2的調(diào)控依賴TrkB的激活,我們分別給予體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元TrkB下游三條經(jīng)典信號通路抑制劑U0126(MAPK信號通路抑制劑),U73122(PLCγ信號通路抑制劑),LY294002(PI3K信號通路抑制劑)30min預(yù)處理后,BDNF 刺激 2h,與 BDNF 組相比較,U0126+BDNF、U73122+BDNF、LY294002+BDNF組p-MLC2灰度值無明顯變化(p0.05),這提示我們BDNF對p-MLC2的調(diào)控不是通過三條經(jīng)典信號通路發(fā)揮作用。接下來給予TrkB下游SRC信號通路抑制劑PP1 30min后,BDNF刺激2h,與BDNF組相比較,PP1+BDNF組p-MLC2灰度值顯著降低(p≤0.05)。分別干擾SRC家族成員,發(fā)現(xiàn)干擾掉LYN激酶后加BDNF刺激時p-MLC2無明顯升高。4、LYN作為上游蛋白調(diào)節(jié)MLCK磷酸化水平我們通過免疫共沉淀的方法,檢測LYN-Myc與MLCK-HA是否存在結(jié)合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LYN與MLCK存在相互作用。接下來干擾掉LYN的表達,BDNF刺激2h,p-MLCK的灰度值顯著下降(p0.05),同時過表達LYN后p-MLCK顯著增加(p0.05)。結(jié)論:通過一系列的細(xì)胞及分子生物相關(guān)實驗,我們證明了 BDNF通過激活SRC信號通路上調(diào)MLCK磷酸化水平從而增加MLC2的磷酸化水平。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q42

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