本文選題：LRSAM1 + E3泛素連接酶　； 參考：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：泛素化是一種重要的蛋白翻譯后修飾形式,它在真核生物的許多生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,如蛋白降解,DNA損傷修復(fù),免疫應(yīng)答,信號傳導(dǎo),自噬,凋亡等。泛素化過程涉及三種酶,即E1泛素激活酶,E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶。通過這三種酶的依次級聯(lián)傳遞,最后把泛素分子連接到特異性底物蛋白上。其中E3泛素連接酶在這個過程中起關(guān)鍵性的特異性識別作用。目前已知的人類E3泛素連接酶約有600種,它們主要分為三大類:RING型(包括RING-like型,如U-Box和PHD等)、HECT型以及RBR型。主要區(qū)別是RING型E3調(diào)控泛素分子向底物的轉(zhuǎn)移是直接的,HECT型需先轉(zhuǎn)移到自身的活性半胱氨酸上,再轉(zhuǎn)移至底物,是一個間接的過程。RBR型E3含有多個RING結(jié)構(gòu)域,轉(zhuǎn)移泛素機(jī)制與HECT型類似。LRSAM1屬于RING-finger型E3泛素連接酶,擁有典型的C3HC4結(jié)構(gòu)。全長LRSAM1擁有723個氨基酸,包含有一個LRR結(jié)構(gòu)域,兩個CC結(jié)構(gòu)域,一個SAM結(jié)構(gòu)域和一個與活性相關(guān)的RING結(jié)構(gòu)域。RING結(jié)構(gòu)域與其E3活性有關(guān),但是對其它結(jié)構(gòu)域的功能作用知之甚少。并且與其它E3蛋白相比,LRSAM1蛋白的結(jié)構(gòu),功能,活性調(diào)控,定位,信號傳導(dǎo)等有待進(jìn)一步深入研究。對LRSAM1分子自我活性調(diào)控研究是對后期一切功能和結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ),但是目前尚未有關(guān)LRSAM1蛋白的活性調(diào)控的報道。我們制備并純化了LRSAM1的多克隆抗體,對其特異性和效價進(jìn)行了評估,并用于后期活性調(diào)控實(shí)驗(yàn)。隨后從其結(jié)構(gòu)域入手,通過體外泛素化重組實(shí)驗(yàn)和哺乳細(xì)胞表達(dá)重組實(shí)驗(yàn),分析了LRSAM1 E3活性調(diào)控過程。我們用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化了高純度的不含冗余tag的全長LRSAM1蛋白作為抗原,免疫新西蘭大白兔獲得抗體血清。用溴化氰活化的瓊脂糖交聯(lián)LRSAM1抗原蛋白,通過親和層析的方法純化LRSAM1多克隆抗體,對其特異性進(jìn)行檢測表明其特異性良好,為后期實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。許多E3連接酶都能形成分子間的寡聚以調(diào)控其E3功能或者活性。通過戊二醛交聯(lián)試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)LRSAM1分子間也存在自締結(jié)現(xiàn)象。體外實(shí)驗(yàn)中失活的LRSAM1ΔRING可以被野生型LRSAM1WT識別并泛素化。細(xì)胞過表達(dá)兩種標(biāo)簽的LRSAM1,可以通過IP證明LRSAM1的分子間相互作用。為尋找LRSAM1分子間相互作用的最小區(qū)域,通過分子間泛素化實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)LRR和CC1結(jié)構(gòu)域能被另一LRSAM1分子泛素化。其中LRR可被單泛素化而CC1可被多泛素化,LRR結(jié)構(gòu)域含有13個保守的賴氨酸,但是它只發(fā)生了單一的泛素遷移帶,為探明此單泛素化位點(diǎn),我們構(gòu)建了LRR的賴氨酸突變體,通過對13個賴氨酸突變體的泛素化情況分析,結(jié)果表明賴氨酸不是LRR結(jié)構(gòu)域的泛素化位點(diǎn)。最終通過兩個獨(dú)立的NH2基團(tuán)封閉實(shí)驗(yàn)表明LRR結(jié)構(gòu)域的單泛素化位點(diǎn)發(fā)生在N端的α-NH2上。對構(gòu)建的LRSAM1氨基端缺失突變體的活性檢測時發(fā)現(xiàn),其N端串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域有明顯增強(qiáng)LRSAM1 E3活性的作用。當(dāng)LRSAM1只保留其最小活性組件RINGfinger結(jié)構(gòu)域時,在相同濃度條件下,RING結(jié)構(gòu)域的活性幾乎檢測不到,當(dāng)其濃度提高至20倍時檢測到泛素梯度帶。當(dāng)RING結(jié)構(gòu)域與其N段結(jié)構(gòu)域串聯(lián),其活性不斷增強(qiáng),并且LRSAM1ΔLRR和LRSAM1活性相當(dāng)。體外實(shí)驗(yàn)中除分子間泛素轉(zhuǎn)移被檢測到外,我們還發(fā)現(xiàn)非活性LRSAM1蛋白的加入極大的減弱了與之重組的LRSAM1蛋白的活性,但是對野生型和LRSAM1ΔLRR沒有此種作用。為進(jìn)一步探究是LRSAM1蛋白的哪一部分結(jié)構(gòu)調(diào)控了此種活性的下降,我們進(jìn)一步構(gòu)建了單個結(jié)構(gòu)域突變體和多個結(jié)構(gòu)域串聯(lián)突變體,并用它們與含有RING結(jié)構(gòu)域的活性突變體LRSAM1蛋白進(jìn)行體外泛素化重組實(shí)驗(yàn),其結(jié)果表明SAM或者CC2-SAM結(jié)構(gòu)域的加入能顯著減弱各種LRSAM1突變體的E3活性,乃至對野生型的LRSAM1蛋白也有明顯的活性抑制作用。所以我們確定單獨(dú)的CC2-SAM結(jié)構(gòu)有抑制LRSAM1 E3活性的作用�？紤]到LRSAM1ΔRING對野生型和LRSAM1ΔLRR沒有抑制作用,說明有某種結(jié)構(gòu)能夠拮抗CC2-SAM調(diào)控的抑制作用。通過串聯(lián)突變體與LRSAM1的體外重組實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)與CC2-SAM串聯(lián)的CC1結(jié)構(gòu)域能顯著拮抗掉此種抑制作用,而不是單獨(dú)加入的CC1結(jié)構(gòu)域。最后我們在哺乳細(xì)胞中過表達(dá)底物蛋白TSG101和LRSAM1相關(guān)蛋白,研究LRSAM1對于底物的泛素化是否也受到相同的調(diào)控,得到了與體外一致的結(jié)論。綜上所述,我們通過原核表達(dá)系統(tǒng)得到高質(zhì)量的LRSAM1抗原蛋白,并對其多克隆抗體進(jìn)行了制備,表明其擁有較好的特異性,并用于后續(xù)活性調(diào)控研究。雖然擁有LRR結(jié)構(gòu)域的E3蛋白有一部分因其LRR的存在而自抑制,我們的結(jié)果表明,LRR結(jié)構(gòu)域在LRSAM1 E3活性調(diào)控中沒有自抑制作用。并且C端的RINGfinger結(jié)構(gòu)域與其N端的結(jié)構(gòu)域串聯(lián)可以增大其E3活性的功能。LRSAM1分子間通過自締結(jié)形成寡聚,這促使了分子間泛素分子的轉(zhuǎn)移,即LRSAM1蛋白能與自身其它分子相互識別并促使分子間泛素化的發(fā)生。在研究這種分子間泛素化調(diào)控時,我們發(fā)現(xiàn)CC2-SAM結(jié)構(gòu)域的額外加入能顯著抑制LRSAM1 E3活性,并且只有與CC2-SAM串聯(lián)的CC1能拮抗此種抑制,而單獨(dú)加入的CC1結(jié)構(gòu)域則沒有此種作用。同時我們發(fā)現(xiàn)LRR結(jié)構(gòu)域能通過分子間泛素分子的轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)N端的單泛素化。
[Abstract]:Human E3 ubiquitin ligase ( LRSAM1 ) belongs to a RING - finger type E3 ubiquitin ligase . In vitro experiments , we found that the structure of LRR could significantly attenuate the activity of LRSAM1 protein . In addition , we found that there was no inhibitory effect on the activity of LRSAM1 .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q75

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本文編號：1731962