本文關(guān)鍵詞：Pseudomonas donghuensis HYS對Caenorhabditis elegans毒性作用的初步探究　出處：《武漢大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：實驗室前期工作中發(fā)現(xiàn)一株從東湖水域分離出的高產(chǎn)鐵載體的菌株,進行全基因組測序并定為假單胞菌屬,命名為Pseudomonas donghuensis HYS~T。假單胞菌與宿主之間的相互作用關(guān)系已有大量研究報道,其中,秀麗隱桿線蟲作為一種模式生物,被大量運用于相互作用關(guān)系的研究中。假單胞菌對秀麗隱桿線蟲的毒性致死作用模型基本分為兩種,一種是慢性致死作用模型,一種是急性致死作用模型。據(jù)已有文獻報道,在慢性致死作用模型中,銅綠假單胞菌對秀麗隱桿線蟲具有毒性作用,通過實驗證明Pseudomonas dongyuensis HYS~T 對秀麗隱桿線蟲的毒性作用更為明顯。為了探究Pseuddomonas donghuensis HYS~T對秀麗隱桿線蟲的毒性作用機制,采取構(gòu)建菌株的全基因組轉(zhuǎn)座子插入突變庫的方法,篩選功能基因。利用慢性致死作用模型對具有減毒性狀的突變株進行篩選,通過初篩復篩得到性狀穩(wěn)定的減毒突變株,然后利用Tail-PCR、半隨機引物PCR法進行轉(zhuǎn)座子側(cè)翼序列的調(diào)取,從而得到相關(guān)的功能基因。通過兩輪篩選后鑒定出來15個基因。在篩選出的基因中,位于基因組Scaffold 15 32640-32641處的基因enoly-CoA hydratase已篩到6次,并且與已報道的銅綠假單胞菌中對秀麗隱桿線蟲有毒性作用的PA0745有較高同源性,該基因引起重視,構(gòu)建該基因的敲除菌株和回補菌株判斷它對于秀麗隱桿線蟲的毒性功能。通過NCBI分析其基因功能,也可看出該基因具有水合酶活性且參與脂肪酸代謝,利用酶活反應體系進行基因功能的鑒定,通過分析敲除株與野生型脂肪酸含量的差異對其參與的代謝途徑進行驗證。實驗結(jié)果表明該基因編碼蛋白具有水合酶活性且參與脂肪酸代謝。分析該基因的上下游序列,發(fā)現(xiàn)上游4個基因位置關(guān)系排列緊密,猜想為一個基因簇并通過共轉(zhuǎn)錄檢測得以驗證。另外,將最上游基因進行敲除后發(fā)現(xiàn)敲除株具有減毒作用。此外,篩選到了兩個基因 NAD dependent epimerase和polyketi 和 cyclase,分別位于基因組 Scaffold 14 105154-105155、Scaffold 14 107680-107681 上,這兩個基因排列緊密,猜測位于同一個基因簇上,于是將這兩個基因的上下游基因調(diào)取出來,觀察排布,進行共轉(zhuǎn)錄檢測。檢測結(jié)果表明這些基因均共轉(zhuǎn)錄,位于同一個基因簇上。將基因NADdependent epimerase敲除后,菌株對秀麗隱桿線蟲的毒性明顯減弱,說明該基因?qū)π沱愲[桿線蟲具有毒性作用。但該基因簇具體對秀麗隱桿線蟲的作用,以及這兩個基因間的相互關(guān)系仍需進一步探索。綜上所述,本研究通過構(gòu)建菌株的插入突變庫并利用慢性致死作用模型初步探究了Pseudomonas donghuensis HYS~T對秀麗隱桿線蟲的毒性作用機制。重點探究了篩選得到的兩個基因 enoly-CoA hydratase,NAD dependent epimerase以及所在基因簇對秀麗隱桿線蟲的毒性作用,并推測產(chǎn)生毒性的原因。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q93

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