本文關鍵詞：TBC1D15的Rab-GAP活性研究及其進化特點分析　出處：《浙江理工大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： TBC1D15 Rab-GAP活性 酶動力學 保守性 進化性

【摘要】：TBC1D15(TBC domain family,member 15)蛋白在物種間具有一個高度保守的TBC域(TBC domain),且影響其活性的關鍵精氨酸殘基位點也高度保守。已有研究表明在小鼠及人中的TBC1D15與其他含有TBC domain的蛋白家族成員相似,都具有Rab-GAP活性,但鯊魚中的TBC1D15研究較少,更未見對TBC1D15的Rab-GAP特異性的演變過程及關鍵氨基酸的改變對其Rab-GAP活性影響的相關研究。本研究選擇了鯊魚(Shark),豬(Sus),鼠(Mus),人(Homo)幾種不同物種的TBC1D15基因進行原核表達及其重組產(chǎn)物純化,結果發(fā)現(xiàn)TBC1D15全長蛋白表達量低,尤其是鯊魚中的TBC1D15容易斷裂,得不到穩(wěn)定的全長蛋白。將這四種物種的TBC1D15蛋白序列截短,得到不同物種的GAP(GTPase activating protein)蛋白截短序列,即決定TBC1D15蛋白Rab-GAP活性的關鍵序列。利用序列比對軟件對Shark,Sus,Mus,Homo的TBC1D15-GAP氨基酸序列進行比對,分析其序列保守性。結果發(fā)現(xiàn)有五個位點的精氨酸殘基在物種Sus,Mus,Homo中均高度保守,但在Shark-TBC1D15-GAP中這五個位點分別由G28、K45、K119、K122、K221氨基酸殘基替代。將Shark-TBC1D15-GAP中的五個不同氨基酸殘基全部突變?yōu)榫彼釟埢?并將其他物種GAP中的該位點的精氨酸殘基全部突變?yōu)閷忯~中的G28、K45、K119、K122、K221氨基酸殘基,通過研究不同物種TBC1D15-GAP突變前后Rab-GAP特異性的規(guī)律變化,分析這些氨基酸位點與TBC1D15進化是否存在關聯(lián)。對四種物種的TBC1D15全長及GAP氨基酸序列進行進化樹分析發(fā)現(xiàn),無論對于全長還是對GAP,物種Mus和Homo的親緣關系較近,Shark與Sus以及Sus和Homo相互之間的親緣關系較遠。故選擇相互間親緣關系較遠的Shark,Sus,Homo三個代表性物種的TBC1D15-GAP進行氨基酸突變及Rab-GAP特異性分析。將Shark/Sus/Homo-TBC1B15-GAP及其突變體基因構建至pETduet-his-sumo載體上并原核表達純化。同時表達純化不同的底物Rab(Rab4/5/7/11)蛋白并濃縮,分別與Shark/Sus/Homo-TBC1B15-GAP及其突變體蛋白反應。首先進行了動力學實驗,比較不同GAP蛋白催化Rab4/5/7/11蛋白水解GTP的速率,分析不同物種TBC1D15-GAP的Rab-GAP活性差異。結果發(fā)現(xiàn),不同物種的TBC1D15-GAP在特定氨基酸位點突變之后,Rab-GAP活性有一定的變化。Shark-TBC1D15-GAP在將五個氨基酸位點G28、K45、K119、K122、K221同時突變?yōu)榫彼釟埢?與野生型Sus-TBC1D15-GA的Rab-GAP活性情況相似。且Homo-TBC1D15-GAP在將五個精氨酸同時突變?yōu)閷赟hark-TBC1D15-GAP中的氨基酸殘基后也與野生型Sus-TBC1D15-GAP活性情況相似。以上結果初步表明這些特定氨基酸位點對TBC1D15的Rab-GAP活性具有一定的影響。進一步對六種GAP蛋白進行了Rab-GAP特異性分析,通過求水解過程中的kcat/Km,比較催化效率來判斷所突變氨基酸位點對不同物種GAP蛋白的活性影響。結果發(fā)現(xiàn),物種Sus和Homo的野生型GAP均對Rab11表現(xiàn)出最大的底物偏愛性,且對Rab11/5/4/7的催化效率依次由高到低,而Shark-TBC1D15-GAP野生型對Rab5具有較大的底物偏愛性,將氨基酸殘基G28、K45、K119、K122、K221都突變?yōu)榫彼釟埢?也對Rab11有最大的底物偏愛性,與野生型Sus-TBC1D15-GAP,Homo-TBC1D15-GAP活性情況類似。進一步表明這些氨基酸殘基可能與TBC1D15的物種進化有關。本課題通過對不同物種TBC1D15-GAP及其突變體蛋白進行Rab-GAP動力學分析及特異性分析,初步驗證了TBC1D15保守域中的五個特定氨基酸殘基可能是TBC1D15進化過程中的關鍵氨基酸殘基。隨著物種的不斷進化,TBC1D15-GAP的底物專一性逐漸偏向Rab11,推測可能與物種進化中對環(huán)境適應能力不斷提高有關。
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 周興文;;從生物進化論到進化生物學[J];生物學教學;2014年11期

2 翁育偉;陳端;張志珊;趙珠英;謝劍鋒;沈曉娜;嚴延生;;福建省登革1型病毒基因組序列測定及進化分析[J];中國人獸共患病學報;2006年11期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 沈路明;利用進化樹研究基因序列的進化[D];廣西大學;2014年

2 馬永軍;兩種新的基于距離構建進化樹的方法[D];湘潭大學;2012年

，

本文編號：1308006