本文關(guān)鍵詞：TBC1D15的Rab-GAP活性研究及其進(jìn)化特點(diǎn)分析　出處：《浙江理工大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： TBC1D15 Rab-GAP活性 酶動(dòng)力學(xué) 保守性 進(jìn)化性

【摘要】：TBC1D15(TBC domain family,member 15)蛋白在物種間具有一個(gè)高度保守的TBC域(TBC domain),且影響其活性的關(guān)鍵精氨酸殘基位點(diǎn)也高度保守。已有研究表明在小鼠及人中的TBC1D15與其他含有TBC domain的蛋白家族成員相似,都具有Rab-GAP活性,但鯊魚中的TBC1D15研究較少,更未見對(duì)TBC1D15的Rab-GAP特異性的演變過(guò)程及關(guān)鍵氨基酸的改變對(duì)其Rab-GAP活性影響的相關(guān)研究。本研究選擇了鯊魚(Shark),豬(Sus),鼠(Mus),人(Homo)幾種不同物種的TBC1D15基因進(jìn)行原核表達(dá)及其重組產(chǎn)物純化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBC1D15全長(zhǎng)蛋白表達(dá)量低,尤其是鯊魚中的TBC1D15容易斷裂,得不到穩(wěn)定的全長(zhǎng)蛋白。將這四種物種的TBC1D15蛋白序列截短,得到不同物種的GAP(GTPase activating protein)蛋白截短序列,即決定TBC1D15蛋白R(shí)ab-GAP活性的關(guān)鍵序列。利用序列比對(duì)軟件對(duì)Shark,Sus,Mus,Homo的TBC1D15-GAP氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),分析其序列保守性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有五個(gè)位點(diǎn)的精氨酸殘基在物種Sus,Mus,Homo中均高度保守,但在Shark-TBC1D15-GAP中這五個(gè)位點(diǎn)分別由G28、K45、K119、K122、K221氨基酸殘基替代。將Shark-TBC1D15-GAP中的五個(gè)不同氨基酸殘基全部突變?yōu)榫彼釟埢?并將其他物種GAP中的該位點(diǎn)的精氨酸殘基全部突變?yōu)閷?duì)應(yīng)鯊魚中的G28、K45、K119、K122、K221氨基酸殘基,通過(guò)研究不同物種TBC1D15-GAP突變前后Rab-GAP特異性的規(guī)律變化,分析這些氨基酸位點(diǎn)與TBC1D15進(jìn)化是否存在關(guān)聯(lián)。對(duì)四種物種的TBC1D15全長(zhǎng)及GAP氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),無(wú)論對(duì)于全長(zhǎng)還是對(duì)GAP,物種Mus和Homo的親緣關(guān)系較近,Shark與Sus以及Sus和Homo相互之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。故選擇相互間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的Shark,Sus,Homo三個(gè)代表性物種的TBC1D15-GAP進(jìn)行氨基酸突變及Rab-GAP特異性分析。將Shark/Sus/Homo-TBC1B15-GAP及其突變體基因構(gòu)建至pETduet-his-sumo載體上并原核表達(dá)純化。同時(shí)表達(dá)純化不同的底物Rab(Rab4/5/7/11)蛋白并濃縮,分別與Shark/Sus/Homo-TBC1B15-GAP及其突變體蛋白反應(yīng)。首先進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),比較不同GAP蛋白催化Rab4/5/7/11蛋白水解GTP的速率,分析不同物種TBC1D15-GAP的Rab-GAP活性差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同物種的TBC1D15-GAP在特定氨基酸位點(diǎn)突變之后,Rab-GAP活性有一定的變化。Shark-TBC1D15-GAP在將五個(gè)氨基酸位點(diǎn)G28、K45、K119、K122、K221同時(shí)突變?yōu)榫彼釟埢?與野生型Sus-TBC1D15-GA的Rab-GAP活性情況相似。且Homo-TBC1D15-GAP在將五個(gè)精氨酸同時(shí)突變?yōu)閷?duì)應(yīng)于Shark-TBC1D15-GAP中的氨基酸殘基后也與野生型Sus-TBC1D15-GAP活性情況相似。以上結(jié)果初步表明這些特定氨基酸位點(diǎn)對(duì)TBC1D15的Rab-GAP活性具有一定的影響。進(jìn)一步對(duì)六種GAP蛋白進(jìn)行了Rab-GAP特異性分析,通過(guò)求水解過(guò)程中的kcat/Km,比較催化效率來(lái)判斷所突變氨基酸位點(diǎn)對(duì)不同物種GAP蛋白的活性影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),物種Sus和Homo的野生型GAP均對(duì)Rab11表現(xiàn)出最大的底物偏愛性,且對(duì)Rab11/5/4/7的催化效率依次由高到低,而Shark-TBC1D15-GAP野生型對(duì)Rab5具有較大的底物偏愛性,將氨基酸殘基G28、K45、K119、K122、K221都突變?yōu)榫彼釟埢?也對(duì)Rab11有最大的底物偏愛性,與野生型Sus-TBC1D15-GAP,Homo-TBC1D15-GAP活性情況類似。進(jìn)一步表明這些氨基酸殘基可能與TBC1D15的物種進(jìn)化有關(guān)。本課題通過(guò)對(duì)不同物種TBC1D15-GAP及其突變體蛋白進(jìn)行Rab-GAP動(dòng)力學(xué)分析及特異性分析,初步驗(yàn)證了TBC1D15保守域中的五個(gè)特定氨基酸殘基可能是TBC1D15進(jìn)化過(guò)程中的關(guān)鍵氨基酸殘基。隨著物種的不斷進(jìn)化,TBC1D15-GAP的底物專一性逐漸偏向Rab11,推測(cè)可能與物種進(jìn)化中對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力不斷提高有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q51

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 周興文;;從生物進(jìn)化論到進(jìn)化生物學(xué)[J];生物學(xué)教學(xué);2014年11期

2 翁育偉;陳端;張志珊;趙珠英;謝劍鋒;沈曉娜;嚴(yán)延生;;福建省登革1型病毒基因組序列測(cè)定及進(jìn)化分析[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2006年11期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 沈路明;利用進(jìn)化樹研究基因序列的進(jìn)化[D];廣西大學(xué);2014年

2 馬永軍;兩種新的基于距離構(gòu)建進(jìn)化樹的方法[D];湘潭大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：1308006