本文關鍵詞：苯乳酸生產(chǎn)菌株LY-78的乳酸脫氫酶基因克隆表達及酶學性質分析

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【摘要】：苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是在食品領域具備廣泛利用價值的一種新型天然生物防腐劑,其突出特性為安全性高,性能穩(wěn)定,抑菌譜廣,不僅可以抑制細菌污染,還可抑制真菌污染,使食品貨架期得以延長。本研究以PLA生產(chǎn)菌株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LY-78來源的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因為研究對象,通過對其全面的生物信息學分析,對具有生物活性的ldh基因構建重組工程菌,使LDH在重組工程菌中得到高效表達,分離純化LDH測定其酶活力,并通過溫度、p H以及金屬離子等影響因素研究其酶學性質。1.乳酸脫氫酶基因的生物信息學分析。5個ldh基因的核苷酸序列及氨基酸序列均具有較高的保守性,均為位于細胞質的熱穩(wěn)定性、非分泌型和非跨膜蛋白,其中除L3-LDH由于缺失NAD+結合結構域和功能位點,可能不具有LDH活性外,D1-LDH、D2-LDH、L1-LDH和L2-LDH均具有完整的功能位點和結構域,均存在典型的NAD+結合位點基序GXGXXG,很可能具有真正的LDH活性。因此后續(xù)只進行l(wèi)dh D1、ldh D2、ldh L1和ldh L2基因重組工程菌的構建。2.乳酸脫氫酶基因重組工程菌的構建。通過PCR技術獲得ldh基因,對其進行克隆和亞克隆后,經(jīng)雙酶切及測序鑒定,結果表明成功構建了4個ldh基因重組工程菌;經(jīng)SDS-PAGE鑒定,結果顯示ldh D1、ldh D2、ldh L1以及l(fā)dh L2基因在重組工程菌中均高效表達;分別對高效表達的LDH產(chǎn)物分離純化后,采用反相高效液相色譜法鑒定酶活,結果表明成功獲得了具有催化苯丙酮酸產(chǎn)生PLA的D1-LDH、D2-LDH、L1-LDH以及L2-LDH,且其蛋白分子量依次約為37 k Da、35 k Da、34 k Da和33 k Da,與理論值相一致。3.重組乳酸脫氫酶酶學性質的分析。通過對酶活力的測定得出D1-LDH、D2-LDH、L1-LDH以及L2-LDH對苯丙酮酸比活力依次為65.35 U/mg、0.4123 U/mg、38.80 U/mg和0.1657 U/mg。結果表明植物乳桿菌LY-78中4個LDH中具有較高比活力的是D1-LDH與L1-LDH,對其酶學性質進一步探究表明:D1-LDH與L1-LDH對苯丙酮酸的最佳作用溫度分別為30℃與40℃,最佳作用p H均為6.0,L1-LDH比D1-LDH具有更好的熱穩(wěn)定性和p H穩(wěn)定性;Fe2+和Cu2+是D1-LDH和L1-LDH的抑制劑,而Mg2+和Mn2+是兩者激活劑;在各自最適條件下測得D1-LDH和L1-LDH動力學常數(shù)依次Km為2.86 m M和3.77 m M,Vmax為1.272μmol/min和1.954μmol/min,Kcat為102 s~(-1)和219 s~(-1),Kcat/Km為36 m M~(-1)s~(-1)和58 m M~(-1)s~(-1)。結果表明D1-LDH對苯丙酮酸具有更強的親和力,更有利于PLA的合成。綜上所述,植物乳桿菌LY-78中4個LDH均具有催化還原苯丙酮酸生產(chǎn)PLA的能力,但是其酶活存在非常明顯的差異,其中D1-LDH和L1-LDH對苯丙酮酸具有較高的酶活力,表明這2個酶在植物乳桿菌LY-78生物合成PLA途徑中具有突出作用。
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;TS202.3

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1 龔志，

本文編號：1284020