本文關鍵詞：指導RNA偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子抑制基因表達及雙鏈斷裂引起DNA重組的研究

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【摘要】：儲存在基因組中的遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯,進而形成蛋白質(zhì)分子的過程,我們稱之為基因表達。這種翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子具有生物活性。植物體內(nèi)各種酶和功能蛋白質(zhì)都是由其相應的結(jié)構(gòu)基因表達產(chǎn)生。真核生物的轉(zhuǎn)錄起始通常需要轉(zhuǎn)錄因子的共同參與,過程比原核生物復雜得多。首先,轉(zhuǎn)錄起始過程由RNA聚合酶Ⅱ與轉(zhuǎn)錄因子共同參與,它們通過結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復合體而發(fā)揮作用。就目前研究來看,對基因表達調(diào)控的研究已經(jīng)成為一種重要手段,可以幫助我們?nèi)チ私馓囟ɑ虻墓δ�。對特定基因表達的調(diào)控方法有很多種,但主要方式有:RNA干涉(RNA interference,RNAi)法、DNA結(jié)合蛋白,如鋅指蛋白(Zinc Finger,ZF)、CRISPR/Cas技術。在本研究中,我們建立了一種簡單、精確和高效的新型抑制植物基因表達的技術體系。將綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)、指導RNA(guide RNA,gRNA)和編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子與噬菌體外殼融合蛋白的三種基因構(gòu)建到植物表達載體中。利用農(nóng)桿菌侵染本氏煙草葉片,介導植物瞬時表達。研究顯示GFP基因在煙草葉片中的表達受到顯著抑制,抑制率達到41.5%。此系統(tǒng)可運用于對其他基因進行基因調(diào)控,由于只需要改變gRNA,而其他組成原件保持不變,因此該技術具有操作簡單及具有廣泛適應性等特點。該技術可以精確抑制植物基因組中基因表達,為基因表達抑制提供了有效的工具。近年來,基因組編輯技術研究逐步發(fā)展起來,這是一種可以進行DNA定點突變的方法技術。一種新的、高效的基因組編輯技術方法能夠?qū)崿F(xiàn)特異性位點的突變,要求人為設計簡單方便,并且對目的基因序列具有高度靈活的選擇性。目前,鋅指核酸酶技術、RNA介導的規(guī)律成簇間隔短回文重復序列系統(tǒng)和類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶等基因組編輯技術得到廣泛應用。它們都可以精確地在DNA雙鏈的特定位點上產(chǎn)生切口,進而實現(xiàn)基因插入、缺失和堿基替換等突變。相比于傳統(tǒng)的基因組編輯技術,這些新的基因編輯技術不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對DNA進行定點修飾,而且還能應用到更多的物種上,可以使大大提高基因定點突變的效率。此外,其載體構(gòu)建成本相對低、時間相對較短,使基因組的定點突變成為可能。然而,最近的研究發(fā)現(xiàn),脫靶效應在這些系統(tǒng)中普遍存在。本研究構(gòu)建了一種新型的定點基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控技術,即指導RNA偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(gRNA and Tethered Transcriptional Regulator,GRATR)。我們發(fā)現(xiàn),在GRATR系統(tǒng)介導的抑制基因表達的研究中,與雙鏈DNA堿基互補配對的gRNA能夠引起DNA的斷裂并使DNA發(fā)生重組。將綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)、指導RNA(guide RNA,gRNA)兩種基因片段構(gòu)建到植物表達載體中。利用農(nóng)桿菌侵染本氏煙草葉片,介導植物瞬時表達。研究顯示GFP基因在煙草葉片中的表達受到顯著抑制,抑制率達到36.4%。只需要改變gRNA,此系統(tǒng)可運用于對其他基因的定點突變。
【學位授予單位】：聊城大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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