本文關(guān)鍵詞：利用基因工程技術(shù)篩選高產(chǎn)賴氨酸芽孢桿菌的研究

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【摘要】：枯草芽孢桿菌產(chǎn)賴氨酸的代謝途徑中最重要的產(chǎn)物是高絲氨酸,其代謝關(guān)鍵酶的編碼基因是hom,在該代謝途徑中如果敲除該基因,就可以使代謝流流向賴氨酸合成,使賴氨酸產(chǎn)量增加。所以本試驗(yàn)旨在利用基因工程技術(shù)選育枯草芽孢桿菌YB83高絲氨酸脫氫酶(homm)缺失株,研究homm基因缺失株對(duì)產(chǎn)賴氨酸產(chǎn)量的影響。模板用枯草芽孢桿菌YB83基因組DNA,PCR擴(kuò)增得到hom基因連接到載體pMD19-T上,在E coliDH5a中轉(zhuǎn)化,篩選得到重組質(zhì)粒pMD19-T-hom。而后用質(zhì)粒pET-28a為模板,PCR擴(kuò)增獲得km基因,將km基因用BssH2酶切后連接到重組質(zhì)粒pMD19-T-hom上,在大腸桿菌E coli DH5a中轉(zhuǎn)化,通過(guò)卡那霉素抗性篩選得到質(zhì)粒載體pMD19-T-hom::km。通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法把pMD19-T-hom::km在枯草芽孢桿菌YB83中轉(zhuǎn)化,通過(guò)PCR驗(yàn)證成功敲除枯草芽孢桿菌YB83染色體上的hom基因。通過(guò)抗性篩選得到的枯草芽孢桿菌YB83高絲氨酸脫氫酶缺失菌株賴氨酸產(chǎn)量提高了2.07倍,枯草芽孢桿菌YB83缺失菌株經(jīng)過(guò)24h發(fā)酵賴氨酸產(chǎn)量達(dá)0.375g/L,而枯草芽孢桿菌YB83菌株經(jīng)過(guò)24h賴氨酸的產(chǎn)量為0.181g/L。
【關(guān)鍵詞】：基因工程 芽孢桿菌 賴氨酸 高絲氨酸脫氫酶
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q93;Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 研究背景與意義8-15
• 1.1 賴氨酸概述8-12
• 1.1.1 賴氨酸的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)8
• 1.1.2 賴氨酸的功能及用途8-9
• 1.1.3 賴氨酸的生產(chǎn)現(xiàn)狀9-10
• 1.1.4 賴氨酸的生產(chǎn)方法10-11
• 1.1.5 國(guó)內(nèi)外賴氨酸菌種選育發(fā)展的現(xiàn)狀11-12
• 1.2 芽孢桿菌研究現(xiàn)狀12-14
• 1.2.1 芽孢桿菌概述12-13
• 1.2.2 基因工程技術(shù)在芽孢桿菌中的研究進(jìn)展13-14
• 1.3 題背景與意義14
• 1.4 主要研究?jī)?nèi)容14-15
• 2 材料與方法15-26
• 2.1 材料15-18
• 2.1.1 菌種與質(zhì)粒15
• 2.1.2 主要試劑15-16
• 2.1.3 培養(yǎng)基16-17
• 2.1.4 主要藥品17-18
• 2.1.5 主要儀器18
• 2.2 方法18-26
• 2.2.1 枯草芽孢桿菌YB83菌株的培養(yǎng)、篩選與保存18
• 2.2.2 提取枯草芽孢桿菌YB83菌基因組DNA18-19
• 2.2.3 PCR擴(kuò)增HOM基因及回收19-20
• 2.2.4 DNA切膠回收20-21
• 2.2.5 重組質(zhì)粒PMD19-T-HOM的構(gòu)建和鑒定21-22
• 2.2.6 質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒22-23
• 2.2.7 PCR擴(kuò)增卡納抗性基因(KM)23-24
• 2.2.8 構(gòu)建質(zhì)粒載體PTG19-T-HOM::KM24-25
• 2.2.9 制作電擊轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌YB83感受態(tài)25
• 2.2.10 電擊轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌YB8325-26
• 2.2.11 轉(zhuǎn)化子篩選26
• 2.2.12 枯草芽孢桿菌YB83缺陷菌株的培養(yǎng)與保存26
• 2.2.13 枯草芽孢桿菌YB83菌株和枯草芽孢桿菌YB83缺失菌株發(fā)酵液中賴氨酸的測(cè)定26
• 3 結(jié)果與分析26-30
• 3.1 目的基因PCR擴(kuò)增26-27
• 3.2 重組質(zhì)粒PMD19-T-HOM的驗(yàn)證27-28
• 3.3 質(zhì)粒載體PMD19-T-HOM::KM的構(gòu)建和鑒定28-29
• 3.4 電擊轉(zhuǎn)化結(jié)果的驗(yàn)證29
• 3.5 枯草芽孢桿菌YB83中HOM基因缺失菌株的形態(tài)鑒定29
• 3.6 枯草芽孢桿菌YB83中HOM基因缺失對(duì)賴氨酸產(chǎn)量的影響29-30
• 4 討論30-32
• 5 結(jié)論32
• 6 創(chuàng)新點(diǎn)32-33
• 參考文獻(xiàn)33-38
• 致謝38-39
• 作者簡(jiǎn)介39

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