水環(huán)境污染是全球關(guān)注的熱點問題之一。全球每年都有大量的毒物通過各種途徑進入水環(huán)境中,包括重金屬在內(nèi)的眾多污染物對生物體都具有潛在的毒性。如果不能及時地發(fā)現(xiàn)毒物、檢測其毒性以及對其潛在危害做出預(yù)測,那么極有可能造成嚴(yán)重的生態(tài)危機。因此建立靈敏、快速的生物檢測體系對污染物的毒性進行早期預(yù)警和生態(tài)風(fēng)險評估就顯得極其重要。利用體外培養(yǎng)的細(xì)胞系作為體外模型進行污染物毒性檢測的體外檢測系統(tǒng)具有細(xì)胞均一性好、遺傳相似、反應(yīng)速度快、經(jīng)濟、方便等眾多優(yōu)點,使得其在毒理學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛。由于現(xiàn)在建立的魚類細(xì)胞系的種類和數(shù)量繁多,而每種細(xì)胞系對毒物的反應(yīng)又存在較大差異,因此,需要通過檢測不同的污染物對不同細(xì)胞系的毒性,以確立敏感的、適合的細(xì)胞體外模型應(yīng)用于其毒性早期預(yù)警的研究。 本文主要研究魚類細(xì)胞體外模型對檢測我國水體中常見的四種重金屬——鎘(Cd)、鉻(Cr)、鋅(Zn)、銅(Cu)的毒性敏感性和適用性。通過比較不同培養(yǎng)代數(shù)、不同物種、不同組織來源的早期傳代細(xì)胞系和永生性細(xì)胞系對重金屬的毒性敏感性,確立每種重金屬的相對敏感細(xì)胞系,然后以毒性敏感細(xì)胞系為體外模型檢測重金屬的細(xì)胞毒性、氧化損傷和基因毒性,探討敏感的、適用的魚類細(xì)胞體外模型在重金屬毒性檢測中的應(yīng)用前景,主要研究結(jié)果如下: 1、三株魚類細(xì)胞系的建立 利用組織塊貼壁法新建了胭脂魚(Myxocyprinus asiaticu)肌肉細(xì)胞系CSM與吻端組織細(xì)胞系CSSN以及稀有泩鯽(Gobiocypris rarus)鰭條細(xì)胞系RMF三株細(xì)胞系,并通過細(xì)胞計數(shù)研究其最適生長條件和凍存復(fù)蘇能力,通過染色體分析和線粒體基因分析鑒定其遺傳種質(zhì)。結(jié)果表明新建的三株細(xì)胞系均為成纖維貼壁型細(xì)胞,形態(tài)較均一;三株細(xì)胞系均能在含10%FBS的L-15培養(yǎng)液及25℃的培養(yǎng)條件下具有連續(xù)傳代能力,其中CSM的最適培養(yǎng)液為M199;凍存的5~(th)、10~(th)、15~(th)細(xì)胞的復(fù)蘇能力較強,其復(fù)蘇后存活率均在90%以上,貼壁率在50%-80%之間;染色體分析表明新建細(xì)胞系雖然存在染色體缺失與增多現(xiàn)象,但仍為正常四倍體細(xì)胞(染色體條數(shù)100,CSM和CSSN細(xì)胞系)和二倍體細(xì)胞(染色體條數(shù)為50,RMF細(xì)胞系);線粒體基因(12s rRNMl8s rRNA、cytb)分析表明PCR擴增的基因片段序列與其來源魚類的發(fā)表序列完全一致�？梢�,新建的三株魚類細(xì)胞系具有體外連續(xù)傳代能力且未發(fā)生遺傳突變,可作為早期培養(yǎng)細(xì)胞模型應(yīng)用于水環(huán)境污染物的毒性檢測。 2、十二株魚類細(xì)胞系對檢測重金屬毒性的敏感性研究 (1)首先,利用MTT法(以IC50值為指標(biāo))和細(xì)胞總蛋白含量測定法(CB法)(以IC50值為指標(biāo))檢測氯化鎘(CdCl_2·2.5H_2O)、重鉻酸鉀(K_2Cr_2O_7)、氯化鋅(ZnCl_2)、硫酸銅(CuSO_4·5H_2O)對草魚CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性,利用彗星實驗法(SCGE法)(以DNA損傷率為指標(biāo))以及PI染色流式細(xì)胞儀法(FCM法)(以細(xì)胞凋亡率為指標(biāo))檢測鎘、鉻(Ⅵ)、鋅、銅對草魚CIK細(xì)胞的基因毒性。結(jié)果表明四種體外檢測方法均能通過不同的指標(biāo)定性比較重金屬對草魚CIK細(xì)胞的毒性大小,其檢測出重金屬的毒性大小均為Cd＞Cr＞Cu＞Zn;兩種重金屬細(xì)胞毒性檢測方法——MTT法和CB法得到的四種重金屬的IC50值無顯著性差異;綜合比較這四種方法的優(yōu)缺點,確定了MTT法為簡單、快速、重復(fù)性好的重金屬毒性敏感細(xì)胞系體外檢測方法。 (2)其次,利用MTT法,以IC50值為指標(biāo),比較了三株不同物種、不同組織來源、不同培養(yǎng)代數(shù)的新建細(xì)胞系,以及來源于不同組織、不同物種的九株永生性魚類細(xì)胞系對重金屬毒性的敏感性。結(jié)果表明隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加,三株新建細(xì)胞系對重金屬的毒性敏感性有所下降,但在20代之內(nèi)未見顯著性差異;同一物種不同組織來源的魚類細(xì)胞系對重金屬的毒性敏感性是不同的;同一組織來源的不同物種的魚類細(xì)胞系對重金屬的毒性敏感性也是不同的,且早期傳代細(xì)胞系不一定比永生性細(xì)胞系對重金屬的毒性更敏感;確定了氯化鎘的毒性敏感細(xì)胞系為斑點叉尾洶卵巢細(xì)胞系CCO,重鉻酸鉀和氯化鋅的毒性敏感細(xì)胞系均為鯉上皮瘤細(xì)胞系EPC,硫酸銅的毒性敏感細(xì)胞系為草魚腎臟組織細(xì)胞系CIK。 3、毒性敏感細(xì)胞系在重金屬毒性檢測中的應(yīng)用 以上述研究確定的毒性敏感細(xì)胞系作為體外模型,通過細(xì)胞形態(tài)觀察,MTT法和CB法檢測重金屬的細(xì)胞毒性,采用脂質(zhì)過氧化水平、GPX和SOD酶活性的測定檢測重金屬造成的氧化損傷,利用彗星實驗法檢測DNA的損傷,使用流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。結(jié)果表明重金屬能引起細(xì)胞發(fā)生變圓、崩解、脫落,并抑制細(xì)胞生長,顯著降低細(xì)胞存活率,引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物水平增加,造成細(xì)胞GPX和SOD酶活性下降,總抗氧化能力減弱,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷;使細(xì)胞DNA單鏈發(fā)生斷裂,發(fā)生DNA損傷;并引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期時相改變,且這些作用均呈濃度依賴關(guān)系�？梢�,確定重金屬毒性敏感細(xì)胞系進行其毒性早期預(yù)警是可行的,并且可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測重金屬的毒性作用。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：X174
【部分圖文】：

組織塊邊緣第二天就有細(xì)胞長出，這些細(xì)胞長勢迅猛但輪廓不太清晰，可能是粘液細(xì)胞，幾天后發(fā)現(xiàn)這些慢慢死掉。在這些細(xì)胞死掉之后從組織塊下面長出的細(xì)胞形態(tài)健康，輪廓清晰，經(jīng)過3一4天就可以形成有規(guī)模的細(xì)胞克隆(圖2一l)，再經(jīng)過5一6天就能在組織塊之間形成細(xì)胞單層，這時就可以用TVS消化進行第一次傳代培養(yǎng)。三種組織的原代培養(yǎng)表現(xiàn)出相似的生長模式，先是長出上皮樣細(xì)胞，慢慢再長出成纖維狀細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)TVS分次消化2一5而n后，大多數(shù)細(xì)胞邊緣卷起，脫離瓶壁變圓，收集細(xì)胞后接種于新的培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞在24h后基本能貼壁。視初次傳代接種的細(xì)胞密度，細(xì)胞5一8天接近長滿瓶壁，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞分別呈長梭形(CSM、CSSN)和短梭形(RMF)。經(jīng)過3一5次傳代后，細(xì)胞逐漸長成整齊的成纖維狀細(xì)胞(圖2一2)。細(xì)胞在傳代8次以后，就能在25℃或室溫下很容易保持其快速生長。

圖2-2胭脂魚肌肉細(xì)胞系CSM、吻端組織細(xì)胞系CSSN和稀有的娜鰭條細(xì)胞系R州田的細(xì)胞形態(tài)觀察A，CSM;B，CSSN;C，RMF。放大倍數(shù):SOxFig.2·2Photo而crograPhyofeelllinesCSMandCSSNderivedfromChinesesuckerandRM[Fderivedf比m段代minnowA，CSM:B，CSSN:C，RMEMagnification:SOX3.2細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇能力分別對三株新建細(xì)胞的5代，ro代和巧代凍存的細(xì)胞進行復(fù)蘇，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果如表2一1所示三株細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的存活率均在90%以上，其細(xì)胞貼壁率也在50%一80%之間。復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)、生長狀況與未凍存的細(xì)胞基本類似，未見明顯區(qū)別，凍存時間對其影響也不大。表2-1新建細(xì)胞系的凍存復(fù)蘇能力

圖2.6三株細(xì)胞系的染色體條數(shù)分布及染色體形態(tài)。A:CSM;B:CSSN;C.RMF。放大倍數(shù):1以X)xFig.2·6ThefrequencydistributionofehromosomesOfthreenewlyes妞blishedcellstreatedwithcolehieinesandPhase·eontrastPhoto而emgraPhOfthesethreenewes妞blishedeellscellularchromosomesarrestedinme妞Phase.A:CSM:B:CSSN;C.RMEMagnifieation:1000x.3.5線粒體基因分析通過對線粒體基因的分析驗證這三株細(xì)胞系的種質(zhì)來源。通過PCR擴增CSM、CSSN基因組中的cytb和125rRNA基因，分別得到503bp和690bp的產(chǎn)物(圖2一7，A);通過PCR擴增RMF基因組中的cytb和185rRNA基因，分別得到840bp和107bP的產(chǎn)物(圖2一7，B)。經(jīng)過測序分析，其序列與發(fā)表的序列一致。

【引證文獻】

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本文編號：2816138