氟蟲腈作為苯吡唑類殺蟲劑,因具有高效的殺蟲活性,而一度被廣泛地使用。但由于氟蟲腈對環(huán)境中非靶標(biāo)生物,尤其是水生生物造成嚴(yán)重危害,因此,多個國家已經(jīng)限制其在農(nóng)業(yè)上的使用。氟蟲腈在環(huán)境中的殘留所引發(fā)的對非靶標(biāo)生物的高毒性成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點話題。本文通過二代測序、實時熒光定量PCR(qPCR)及流式細(xì)胞術(shù)等方法,研究了氟蟲腈對斑馬魚幼魚發(fā)育早期階段的急性毒性作用以及氧化脅迫和神經(jīng)信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達影響;氟蟲腈誘導(dǎo)斑馬魚幼魚的DGE表達譜分析及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的初步探究;以及氟蟲腈對人SH-SY5Y和HaCaT細(xì)胞的毒性作用,并且結(jié)合表型變化初步探索了氟蟲腈的毒性機理。本文得到結(jié)果如下:1.發(fā)育75 hpf的斑馬魚幼魚在氟蟲腈中暴露96 h后的死亡率和畸形率顯著升高,對應(yīng)的LC_(50)和EC_(50)值分別為460μg/L和340μg/L;骨骼發(fā)育受到抑制導(dǎo)致體長顯著變短;死亡率、畸形率及體長變化與氟蟲腈濃度之間均呈現(xiàn)一定濃度依賴的關(guān)系。2.亞致死濃度下,斑馬魚幼魚對氟蟲腈產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。CAT、CES、GST、POD、SOD酶活性在濃度分別為0.5、5、50、100μg/L的氟蟲腈處理72 h后均有不同程度的升高,且隨著氟蟲腈脅迫濃度的升高,酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的特征,都在氟蟲腈濃度為5μg/L時,酶活性達到最大值。3.亞致死濃度下,氟蟲腈影響了斑馬魚幼魚神經(jīng)信號傳導(dǎo)相關(guān)基因ache、chat、glrba的表達。氟蟲腈濃度分別為5、10、50、100μg/L時,基因的相對表達量均呈現(xiàn)隨著暴露時間延長而升高。4.在環(huán)境濃度下,發(fā)育75 hpf的斑馬魚幼魚在濃度為0.5、5、50μg/L的氟蟲腈誘導(dǎo)72 h后的DGE表達譜分析結(jié)果顯示,我們獲得了一個高質(zhì)量的DGE測序結(jié)果;3個濃度氟蟲腈誘導(dǎo)下分別得到的差異表達基因數(shù)為58、75和98,其中上調(diào)基因數(shù)分別為2、4和7,下調(diào)基因數(shù)分別為56、71和91,各濃度下共同的差異表達基因數(shù)為44個,其中有9個為轉(zhuǎn)錄因子AP-1蛋白家族的編碼基因;各濃度誘導(dǎo)下分別得到了12、112和23個顯著富集的GO條目,包含生物過程和分子功能兩個GO分類,各濃度誘導(dǎo)下共同富集到的GO條目主要涉及到細(xì)胞增殖、脂肪細(xì)胞代謝及轉(zhuǎn)錄因子活性;分別獲得了7、6、9個顯著富集的通路,其中HTLV-Ⅰinfection(ko05166)、Osteoclast differentiation(ko04380)和Hepatitis B(ko05161)為各濃度誘導(dǎo)下共同富集到的通路;qPCR驗證結(jié)果顯示,15個基因的相對表達量與DGE所得結(jié)果展現(xiàn)出高度的一致性,其Pearson’s相關(guān)系數(shù)r=0.97018且P0.001。5.分析了轉(zhuǎn)錄因子JDP2、Fosab和MIDN的編碼基因在環(huán)境濃度為50μg/L的氟蟲腈誘導(dǎo)下72 h后的相對表達量。JDP2和Fosab兩個轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控破骨細(xì)胞的生成與分化,推測jdp2b和fosab基因的顯著下調(diào)表達能影響斑馬魚幼魚的骨骼生長和發(fā)育,從而導(dǎo)致幼魚脊柱彎曲或體長變短;JDP2能抑制細(xì)胞增殖及原癌基因的轉(zhuǎn)化,推測jdp2b基因顯著下調(diào)對發(fā)育早期的斑馬魚幼魚有致癌風(fēng)險;midn基因的相對表達量與氟蟲腈的環(huán)境濃度呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系,可以成為斑馬魚幼魚對環(huán)境濃度氟蟲腈響應(yīng)的新的潛在生物標(biāo)記物;此外,MIDN是帕金森病致病機制中重要的調(diào)控因子,推測氟蟲腈誘導(dǎo)的midn基因的顯著下調(diào)表達有誘發(fā)魚類等脊椎動物出現(xiàn)類似帕金森病的風(fēng)險。6.SH-SY5Y和HaCaT細(xì)胞都可以響應(yīng)氟蟲腈誘導(dǎo)而導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著下降,且呈負(fù)相關(guān)性,HaCaT細(xì)胞對氟蟲腈誘導(dǎo)表現(xiàn)得更加敏感;兩種細(xì)胞的凋亡率都隨氟蟲腈濃度升高而升高,且隨著氟蟲腈作用時間的延長細(xì)胞凋亡率也在升高,表明氟蟲腈對這兩種人源細(xì)胞具有一定的毒害作用,且這種毒害會隨著時間延長而累積。
【圖文】：

圖 1.1 氟蟲腈化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1.1 chemical formula of fipronil相對密度 1.48-1.63（20℃），熔點 200-201℃。mg/L（20℃，，pH9）。易溶于有機溶劑，20℃下2 g/L，正己烷 0.028 g/L 等（李莎莎, 2015）。

圖 1.2 氟蟲腈在環(huán)境中的主要代謝途徑Fig. 1.2 Main metabolic pathways of fipronil in the environment腈的作用機理的活性很高并十分廣譜，主要作用方式是胃毒，另外有觸殺及中度內(nèi)吸
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X171.5

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本文編號：2605509