發(fā)布時間：2020-07-27 18:15

【摘要】：吲哚廣泛存在于自然界中,微生物、植物和動物代謝都能產(chǎn)生吲哚。研究表明吲哚是焦化廢水和畜牧業(yè)廢水中典型的氮雜環(huán)芳烴污染物,對人類健康和自然環(huán)境產(chǎn)生較大危害,吲哚的微生物轉(zhuǎn)化是該類廢水生物處理和資源化的關鍵。吲哚的生物轉(zhuǎn)化研究始于上世紀20年代,迄今仍存在微生物群落信息缺乏、降解菌資源有限且降解機制不明晰等問題。本論文從微生物群落、純菌特性及功能基因三個層面對吲哚好氧生物轉(zhuǎn)化過程進行系統(tǒng)研究,主要內(nèi)容及結論如下:利用Illumina高通量測序技術解析吲哚好氧轉(zhuǎn)化的微生物群落信息,分別考察了實際焦化污泥和吲哚廢水反應器污泥的微生物群落組成和結構。實際焦化廢水處理廠活性污泥的微生物群落組成較為一致,主要菌屬包括Thiobacillus、Comamonas、Gp4、Azoarcus、Thauera、Kineosporia、Ensifer和Rhodoplanes。進一步構建并運行兩種吲哚模擬廢水生物反應器,分別為市政污泥體系(A體系)和焦化污泥體系(B體系)。兩個體系都能有效去除吲哚并且生成靛藍類物質(zhì)。微生物群落分析表明,當吲哚和葡萄糖共代謝時,Azoarcus和Thauera是污泥中的核心微生物,其在A和B體系中的相對豐度分別為37.94%和24.34%;當吲哚為唯一碳源時,Alcaligenes和Comamonas演變成核心菌屬,其中Alcaligenes在B體系中的豐度高達49.41%,其他主要的菌屬還包括Burkholderia、Pseudomonas 和 Cupriavidus 等。從吲哚馴化的微生物群落體系出發(fā),利用微生物純培養(yǎng)技術獲取吲哚降解菌并考察其降解特性。通過吲哚馴化和反復平板涂布從反應器污泥等樣品中篩選得到6株能以吲哚為唯一碳源生長的菌株,其中菌株Comomonas sp.IDO1、Comomonas sp.IDO2和Xenophilussp.IDO4 能在一周內(nèi)去除 100 mg/L吲哚,菌株Burkholderia sp.IDO3、Cupriavidus sp.IDO和Cupriavidus sp.SHE 降解效率較高,能在 24 h 內(nèi)降解 100 mg/L吲哚。選擇菌株Cupriavidus sp.SHE進行深入研究,高效液相色譜和質(zhì)譜分析表明菌株在吲哚無機鹽培養(yǎng)基中生長時,中間產(chǎn)物為靛紅、靛紅酸和鄰氨基苯甲酸。對菌株SHE進行全基因組和比較蛋白質(zhì)組解析,菌株共有6581個蛋白編碼序列,蛋白質(zhì)組檢測到1117個蛋白,其中118個蛋白顯著上調(diào),59個蛋白顯著下調(diào)。上調(diào)變化的蛋白中有兩個基因簇(基因簇Ⅰ和Ⅱ),序列比對分析表明基因簇Ⅰ可能參與吲哚氧化的過程,基因簇Ⅱ可能參與鄰氨基苯甲酸的代謝過程。以吲哚降解菌株SHE的基因組和蛋白質(zhì)組信息為基礎,利用分子生物學技術闡明菌株SHE降解吲哚機制。RT-qPCR實驗表明基因簇Ⅰ中she5651-she5654 4個基因在吲哚無機鹽培養(yǎng)基中均顯著上調(diào)表達;利用同源重組技術成功得到基因敲除菌SHE-A5652和SHE-A5653A5654,敲除菌的吲哚降解能力顯著降低,且不能以吲哚為唯一碳源進行生長;對基因簇Ⅰ進行克隆實驗,證實該基因簇能夠催化吲哚轉(zhuǎn)化,且she5652是負責吲哚氧化的功能基因,命名為indA。RT-qPCR實驗表明基因簇Ⅱ中she1808-she1814 6個基因在吲哚無機鹽培養(yǎng)基和鄰氨基苯甲酸無機鹽培養(yǎng)基中均顯著上調(diào)表達;基因敲除菌SHE-△1814降解吲哚的能力和野生菌株SHE相似,但不能以吲哚和鄰氨基苯甲酸為唯一碳源生長;對基因she1810進行異源表達和酶學分析,產(chǎn)物分析顯示該蛋白能催化鄰氨基苯甲酸生成鄰氨基苯甲酸輔酶A。綜上分析推測出菌株SHE降解吲哚的機制:吲哚首先在基因簇Ⅰ作用下被氧化,然后生成靛紅和鄰氨基苯甲酸,最后在基因簇Ⅱ作用下通過罕見的鄰氨基苯甲酸輔酶A途徑進一步降解。以吲哚降解過程中的功能蛋白為研究對象,利用生物信息學和基因重組技術探究吲哚加氧酶特性和應用。IndA與Pseudomonas菌株中傳統(tǒng)的苯乙烯單加氧酶StyA相似性為30%左右,與Rhodococcus opacus菌株中新型的苯乙烯單加氧酶StyA1和StyA2B相似性為40-60%,在系統(tǒng)進化樹中屬于一個獨立的分支,該加氧酶在Cupriavidus、Acientobacter和Burkholderia等菌屬中廣泛存在。IndA能在FAD和NADH存在下催化吲哚反應,在37"℃和pH 8.0的磷酸鉀緩沖溶液中催化活性最高,對吲哚的Km和kcat值分別為0.36±0.10 mmol/L和1.53±0.16 min-1,此外IndA還能催化一系列吲哚衍生物反應生成色素類產(chǎn)物。將基因 indAB(she5652-she5651)導入到 Escherichia coli BL2l(DE3)中構建了重組大腸桿菌IND_AB,該菌株能催化色氨酸合成靛藍,最適條件為:溫度30℃,轉(zhuǎn)速150r/min,接種時添加1.0mmol/LIPTG作誘導劑,在色氨酸1g/L、NaCl3.55g/L和酵母浸粉5.12 g/L的培養(yǎng)基中生長48 h,最終靛藍產(chǎn)量為307mg/L,比未優(yōu)化條件下靛藍產(chǎn)量(70 mg/L)提高339%。
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X703;X172
【圖文】：

（１）吲哚的物化性質(zhì)逡逑口引噪，化學式為Ｃ８Ｈ７Ｎ，ＣＡＳ登錄號為１２０－７２－９，由苯環(huán)和Ｈ比略環(huán)并聯(lián)形成的l#雜逡逑環(huán)芳香化合物，又稱苯并吡咯，其結構如圖１．１所示。吲哚的相對分子量為１１７．１５，熔逡逑點５２＿５°Ｃ，沸點２５４．７°Ｃ邋（１０１．３ｋＰａ），密度１．２２ｇ／ｃｍ３（１８°Ｃ）【ｌ】。在室溫條件下吲哚為無逡逑色或白色晶體亮片狀，溶于乙醇、乙醚、苯和丙酮等，在２０°Ｃ水中的溶解度為０．］９ｇ／〗００逡逑ｍＬ左右，但可溶于熱水。吲哚是一種亞胺，濃度低時具有茉莉花香氣，濃度高時具有逡逑糞臭味，該特點與其衍生物３－甲基吲哚類似，但３－甲基吲哚（糞臭素）濃度高時氣味更逡逑加強烈持久。吲哚和３－甲基吲哚在動物腸道和排泄物中共同存在，是產(chǎn)生臭味的主要原逡逑因之一＿。逡逑Ｈ逡逑７邐１逡逑圖１．１吲哚的化學結構逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｉｎｄｏｌｅ逡逑吲哚類物質(zhì)是重要的精細化工中間體，廣泛應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、印染等行業(yè)。例如逡逑吲哚及其衍生物具有一定的生物活性，包括抗炎性、抗菌活性、殺蟲活性以及抗腫瘤活逡逑性等

ｅ邐ＤＩＭＢＯＡ逡逑圖１．２植物合成吲哚的代謝途徑逡逑ＴＳＡ是色氨酸合成酶ａ亞基，ＴＳＢ是色氨酸合成酶ｐ亞基，ＩＧＬ是磷酸－３－甘油磷酸裂解酶，ＢＸ卜７逡逑是合成Ｄ１ＭＢＯＡ的相關酶逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｉｎｄｏｌｅ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ逡逑ＴＳＡ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ａ邋ｕｎｉｔ邋ｏｆ邋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＴＳＢ邋ｉｓ邋Ｐ邋ｕｎｉｔ邋ｏｆ邋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＩＧＬ邋ｉｓ邋ｉｎｄｏｌｅ－３－ｇｌｙｃｅｒｏｌ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｌｙａｓｅ，邋ＢＸ１－７邋ａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｅｄ邋ｅｎｚｙｍｅｓ邋ｆｏｒ邋ＤＩＭＢＯＡ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑部分細菌具有合成吲哚的能力，關于其代謝機制和合成特性研宄比較深入。早在逡逑１８９７年，Ｔｈｅｏｂａｌｄ邋Ｓｍｉｔｈ就發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能夠產(chǎn)生吲哚吲哚在微生物中的代謝途徑逡逑如圖１．３所示。微生物體內(nèi)的色氨酸合成酶基因簇似能夠?qū)⒎种嵋来无D(zhuǎn)化為逡逑鄰氨基苯甲酸、ＩＧＰ、吲哚和色氨酸，但是吲哚作為催化中間產(chǎn)物并不會從色氨酸合成逡逑酶中釋放出來。不同于色氨酸合成酶，色氨酸酶可催化色氨酸生成吲哚、丙酮酸和氨。逡逑色氨酸酶操縱子含有三個基因

，１１引噪會誘導大腸桿菌中多種轉(zhuǎn)運基因的表達，包括ａｃｒＤ，ａｃｒ￡，出和但是這些轉(zhuǎn)運基因在吲哚運輸中的作用還未得到證明［４６ｅ等人一篇關于吲哚的綜述中，提出目前關于吲哚的轉(zhuǎn)運研宄一直何在細胞間運輸對該領域的研究具有重要意義［２６］。在總結前人研ａｎｄｅｚ等人在２０１１年以￡．邋ｃｏ／／為研宄對象，利用體內(nèi)和體外實驗膜間的轉(zhuǎn)運過程［４１１。在該研究中，對吲哚濃度的測定方法進行了胞內(nèi)吲哚濃度的方法往往是首先收集和清洗細胞，然后破碎細胞量，但是由于吲哚能夠迅速的進出細胞，這樣會導致在清洗的過放出來影響實驗結果。作者巧妙的利用了一個基于苯乙烯單加氧，苯乙烯單加氧酶在微生物體內(nèi)表達，能夠高效的將體內(nèi)吲哚轉(zhuǎn)藍進行定量測定即可推算出吲哚的濃度。最后在體外實驗中，測中轉(zhuǎn)運過程，結果表明吲哚的轉(zhuǎn)運不需要轉(zhuǎn)運蛋白的參與，是一然作者不否認轉(zhuǎn)運蛋白如Ｍｔｒ和ＡｃｒＥ可能在吲哚運輸中扮演一被高估了。逡逑—Ｉｎｄｏｌｅ逡逑

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本文編號：2772192