【摘要】：吲哚廣泛存在于自然界中,微生物、植物和動(dòng)物代謝都能產(chǎn)生吲哚。研究表明吲哚是焦化廢水和畜牧業(yè)廢水中典型的氮雜環(huán)芳烴污染物,對(duì)人類(lèi)健康和自然環(huán)境產(chǎn)生較大危害,吲哚的微生物轉(zhuǎn)化是該類(lèi)廢水生物處理和資源化的關(guān)鍵。吲哚的生物轉(zhuǎn)化研究始于上世紀(jì)20年代,迄今仍存在微生物群落信息缺乏、降解菌資源有限且降解機(jī)制不明晰等問(wèn)題。本論文從微生物群落、純菌特性及功能基因三個(gè)層面對(duì)吲哚好氧生物轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)研究,主要內(nèi)容及結(jié)論如下:利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)解析吲哚好氧轉(zhuǎn)化的微生物群落信息,分別考察了實(shí)際焦化污泥和吲哚廢水反應(yīng)器污泥的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)。實(shí)際焦化廢水處理廠活性污泥的微生物群落組成較為一致,主要菌屬包括Thiobacillus、Comamonas、Gp4、Azoarcus、Thauera、Kineosporia、Ensifer和Rhodoplanes。進(jìn)一步構(gòu)建并運(yùn)行兩種吲哚模擬廢水生物反應(yīng)器,分別為市政污泥體系(A體系)和焦化污泥體系(B體系)。兩個(gè)體系都能有效去除吲哚并且生成靛藍(lán)類(lèi)物質(zhì)。微生物群落分析表明,當(dāng)吲哚和葡萄糖共代謝時(shí),Azoarcus和Thauera是污泥中的核心微生物,其在A和B體系中的相對(duì)豐度分別為37.94%和24.34%;當(dāng)吲哚為唯一碳源時(shí),Alcaligenes和Comamonas演變成核心菌屬,其中Alcaligenes在B體系中的豐度高達(dá)49.41%,其他主要的菌屬還包括Burkholderia、Pseudomonas 和 Cupriavidus 等。從吲哚馴化的微生物群落體系出發(fā),利用微生物純培養(yǎng)技術(shù)獲取吲哚降解菌并考察其降解特性。通過(guò)吲哚馴化和反復(fù)平板涂布從反應(yīng)器污泥等樣品中篩選得到6株能以吲哚為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株,其中菌株Comomonas sp.IDO1、Comomonas sp.IDO2和Xenophilussp.IDO4 能在一周內(nèi)去除 100 mg/L吲哚,菌株Burkholderia sp.IDO3、Cupriavidus sp.IDO和Cupriavidus sp.SHE 降解效率較高,能在 24 h 內(nèi)降解 100 mg/L吲哚。選擇菌株Cupriavidus sp.SHE進(jìn)行深入研究,高效液相色譜和質(zhì)譜分析表明菌株在吲哚無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),中間產(chǎn)物為靛紅、靛紅酸和鄰氨基苯甲酸。對(duì)菌株SHE進(jìn)行全基因組和比較蛋白質(zhì)組解析,菌株共有6581個(gè)蛋白編碼序列,蛋白質(zhì)組檢測(cè)到1117個(gè)蛋白,其中118個(gè)蛋白顯著上調(diào),59個(gè)蛋白顯著下調(diào)。上調(diào)變化的蛋白中有兩個(gè)基因簇(基因簇Ⅰ和Ⅱ),序列比對(duì)分析表明基因簇Ⅰ可能參與吲哚氧化的過(guò)程,基因簇Ⅱ可能參與鄰氨基苯甲酸的代謝過(guò)程。以吲哚降解菌株SHE的基因組和蛋白質(zhì)組信息為基礎(chǔ),利用分子生物學(xué)技術(shù)闡明菌株SHE降解吲哚機(jī)制。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)表明基因簇Ⅰ中she5651-she5654 4個(gè)基因在吲哚無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中均顯著上調(diào)表達(dá);利用同源重組技術(shù)成功得到基因敲除菌SHE-A5652和SHE-A5653A5654,敲除菌的吲哚降解能力顯著降低,且不能以吲哚為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng);對(duì)基因簇Ⅰ進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn),證實(shí)該基因簇能夠催化吲哚轉(zhuǎn)化,且she5652是負(fù)責(zé)吲哚氧化的功能基因,命名為indA。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)表明基因簇Ⅱ中she1808-she1814 6個(gè)基因在吲哚無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和鄰氨基苯甲酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中均顯著上調(diào)表達(dá);基因敲除菌SHE-△1814降解吲哚的能力和野生菌株SHE相似,但不能以吲哚和鄰氨基苯甲酸為唯一碳源生長(zhǎng);對(duì)基因she1810進(jìn)行異源表達(dá)和酶學(xué)分析,產(chǎn)物分析顯示該蛋白能催化鄰氨基苯甲酸生成鄰氨基苯甲酸輔酶A。綜上分析推測(cè)出菌株SHE降解吲哚的機(jī)制:吲哚首先在基因簇Ⅰ作用下被氧化,然后生成靛紅和鄰氨基苯甲酸,最后在基因簇Ⅱ作用下通過(guò)罕見(jiàn)的鄰氨基苯甲酸輔酶A途徑進(jìn)一步降解。以吲哚降解過(guò)程中的功能蛋白為研究對(duì)象,利用生物信息學(xué)和基因重組技術(shù)探究吲哚加氧酶特性和應(yīng)用。IndA與Pseudomonas菌株中傳統(tǒng)的苯乙烯單加氧酶StyA相似性為30%左右,與Rhodococcus opacus菌株中新型的苯乙烯單加氧酶StyA1和StyA2B相似性為40-60%,在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中屬于一個(gè)獨(dú)立的分支,該加氧酶在Cupriavidus、Acientobacter和Burkholderia等菌屬中廣泛存在。IndA能在FAD和NADH存在下催化吲哚反應(yīng),在37"℃和pH 8.0的磷酸鉀緩沖溶液中催化活性最高,對(duì)吲哚的Km和kcat值分別為0.36±0.10 mmol/L和1.53±0.16 min-1,此外IndA還能催化一系列吲哚衍生物反應(yīng)生成色素類(lèi)產(chǎn)物。將基因 indAB(she5652-she5651)導(dǎo)入到 Escherichia coli BL2l(DE3)中構(gòu)建了重組大腸桿菌IND_AB,該菌株能催化色氨酸合成靛藍(lán),最適條件為:溫度30℃,轉(zhuǎn)速150r/min,接種時(shí)添加1.0mmol/LIPTG作誘導(dǎo)劑,在色氨酸1g/L、NaCl3.55g/L和酵母浸粉5.12 g/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48 h,最終靛藍(lán)產(chǎn)量為307mg/L,比未優(yōu)化條件下靛藍(lán)產(chǎn)量(70 mg/L)提高339%。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：X703;X172
【圖文】：

（１）吲哚的物化性質(zhì)逡逑口引噪，化學(xué)式為Ｃ８Ｈ７Ｎ，ＣＡＳ登錄號(hào)為１２０－７２－９，由苯環(huán)和Ｈ比略環(huán)并聯(lián)形成的l#雜逡逑環(huán)芳香化合物，又稱(chēng)苯并吡咯，其結(jié)構(gòu)如圖１．１所示。吲哚的相對(duì)分子量為１１７．１５，熔逡逑點(diǎn)５２＿５°Ｃ，沸點(diǎn)２５４．７°Ｃ邋（１０１．３ｋＰａ），密度１．２２ｇ／ｃｍ３（１８°Ｃ）【ｌ】。在室溫條件下吲哚為無(wú)逡逑色或白色晶體亮片狀，溶于乙醇、乙醚、苯和丙酮等，在２０°Ｃ水中的溶解度為０．］９ｇ／〗００逡逑ｍＬ左右，但可溶于熱水。吲哚是一種亞胺，濃度低時(shí)具有茉莉花香氣，濃度高時(shí)具有逡逑糞臭味，該特點(diǎn)與其衍生物３－甲基吲哚類(lèi)似，但３－甲基吲哚（糞臭素）濃度高時(shí)氣味更逡逑加強(qiáng)烈持久。吲哚和３－甲基吲哚在動(dòng)物腸道和排泄物中共同存在，是產(chǎn)生臭味的主要原逡逑因之一＿。逡逑Ｈ逡逑７邐１逡逑圖１．１吲哚的化學(xué)結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｉｎｄｏｌｅ逡逑吲哚類(lèi)物質(zhì)是重要的精細(xì)化工中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、印染等行業(yè)。例如逡逑吲哚及其衍生物具有一定的生物活性，包括抗炎性、抗菌活性、殺蟲(chóng)活性以及抗腫瘤活逡逑性等

ｅ邐ＤＩＭＢＯＡ逡逑圖１．２植物合成吲哚的代謝途徑逡逑ＴＳＡ是色氨酸合成酶ａ亞基，ＴＳＢ是色氨酸合成酶ｐ亞基，ＩＧＬ是磷酸－３－甘油磷酸裂解酶，ＢＸ卜７逡逑是合成Ｄ１ＭＢＯＡ的相關(guān)酶逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｉｎｄｏｌｅ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ逡逑ＴＳＡ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ａ邋ｕｎｉｔ邋ｏｆ邋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＴＳＢ邋ｉｓ邋Ｐ邋ｕｎｉｔ邋ｏｆ邋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＩＧＬ邋ｉｓ邋ｉｎｄｏｌｅ－３－ｇｌｙｃｅｒｏｌ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｌｙａｓｅ，邋ＢＸ１－７邋ａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｅｄ邋ｅｎｚｙｍｅｓ邋ｆｏｒ邋ＤＩＭＢＯＡ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑部分細(xì)菌具有合成吲哚的能力，關(guān)于其代謝機(jī)制和合成特性研宄比較深入。早在逡逑１８９７年，Ｔｈｅｏｂａｌｄ邋Ｓｍｉｔｈ就發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能夠產(chǎn)生吲哚吲哚在微生物中的代謝途徑逡逑如圖１．３所示。微生物體內(nèi)的色氨酸合成酶基因簇似能夠?qū)⒎种嵋来无D(zhuǎn)化為逡逑鄰氨基苯甲酸、ＩＧＰ、吲哚和色氨酸，但是吲哚作為催化中間產(chǎn)物并不會(huì)從色氨酸合成逡逑酶中釋放出來(lái)。不同于色氨酸合成酶，色氨酸酶可催化色氨酸生成吲哚、丙酮酸和氨。逡逑色氨酸酶操縱子含有三個(gè)基因

，１１引噪會(huì)誘導(dǎo)大腸桿菌中多種轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)，包括ａｃｒＤ，ａｃｒ￡，出和但是這些轉(zhuǎn)運(yùn)基因在吲哚運(yùn)輸中的作用還未得到證明［４６ｅ等人一篇關(guān)于吲哚的綜述中，提出目前關(guān)于吲哚的轉(zhuǎn)運(yùn)研宄一直何在細(xì)胞間運(yùn)輸對(duì)該領(lǐng)域的研究具有重要意義［２６］。在總結(jié)前人研ａｎｄｅｚ等人在２０１１年以￡．邋ｃｏ／／為研宄對(duì)象，利用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)らg的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程［４１１。在該研究中，對(duì)吲哚濃度的測(cè)定方法進(jìn)行了胞內(nèi)吲哚濃度的方法往往是首先收集和清洗細(xì)胞，然后破碎細(xì)胞量，但是由于吲哚能夠迅速的進(jìn)出細(xì)胞，這樣會(huì)導(dǎo)致在清洗的過(guò)放出來(lái)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。作者巧妙的利用了一個(gè)基于苯乙烯單加氧，苯乙烯單加氧酶在微生物體內(nèi)表達(dá)，能夠高效的將體內(nèi)吲哚轉(zhuǎn)藍(lán)進(jìn)行定量測(cè)定即可推算出吲哚的濃度。最后在體外實(shí)驗(yàn)中，測(cè)中轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，結(jié)果表明吲哚的轉(zhuǎn)運(yùn)不需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，是一然作者不否認(rèn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如Ｍｔｒ和ＡｃｒＥ可能在吲哚運(yùn)輸中扮演一被高估了。逡逑—Ｉｎｄｏｌｅ逡逑

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 高健;鄧先余;許愛(ài)清;康健;;湘江長(zhǎng)沙段污染沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)與污染物關(guān)聯(lián)性的研究[J];海洋與湖沼;2011年02期

2 程海鷹;孫珊珊;梁建春;汪娟娟;羅一菁;魏利;張忠智;;油藏微生物群落結(jié)構(gòu)的分子分析[J];化學(xué)與生物工程;2008年09期

3 彭芳芳;羅學(xué)剛;王麗超;趙魯雪;;鈾尾礦周邊污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能研究[J];農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào);2013年11期

4 劉永軍;鄭昕;金鵬康;;石油集輸系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)研究[J];微生物學(xué)雜志;2009年03期

5 張燕;周巧紅;張麗萍;王川;賀鋒;吳振斌;;冬季濕地植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2013年11期

6 洪璇;劉彬彬;張曉君;趙立平;;喹啉與吲哚馴化的反硝化反應(yīng)器的微生物群落結(jié)構(gòu)分析比較[J];微生物學(xué)報(bào);2008年04期

7 李佳霖;王中華;秦松;汪光義;;大連長(zhǎng)山群島海岸帶沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)特征[J];微生物學(xué)報(bào);2011年05期

8 楊萌青;李立明;李川;李廣賀;;石油污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與分布特性研究[J];環(huán)境科學(xué);2013年02期

9 滕應(yīng);徐莉;鄒德勛;李振高;駱永明;;多氯聯(lián)苯復(fù)合污染土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化[J];生態(tài)環(huán)境;2007年06期

10 牛佳;周小奇;蔣娜;王艷芬;;若爾蓋高寒濕地干濕土壤條件下微生物群落結(jié)構(gòu)特征[J];生態(tài)學(xué)報(bào);2011年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張海燕;賀江舟;徐彪;張利莉;;新疆南疆連作年限棉田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析[A];中國(guó)微生物學(xué)會(huì)微生物資源專(zhuān)業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)暨第一屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2009年

2 謝冰;米文秀;徐亞同;;石化廢水臭氣的生物處理及微生物群落結(jié)構(gòu)研究[A];第十次全國(guó)環(huán)境微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2007年

3 范艷君;朱玲;;珠江口顆粒附著微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[A];2010年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2011年

4 李學(xué)軍;;蛋白質(zhì)組學(xué)—藥物發(fā)現(xiàn)的新途徑[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第八次全國(guó)代表大會(huì)論文摘要集（第一部分）[C];2002年

5 曾嶸;夏其昌;;蛋白質(zhì)組學(xué)的國(guó)內(nèi)外進(jìn)展[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2003年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要集[C];2003年

6 曾嶸;夏其昌;;蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一些體會(huì)[A];中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2003年

7 石榮;程剛;賀福初;;線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究概述[A];中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2003年

8 嚴(yán)順平;孫衛(wèi)寧;張敏華;蘇維埃;湯章城;;應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究水稻抗鹽機(jī)理[A];中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2003年

9 張國(guó)林;陳子s

本文編號(hào)：2772192