【摘要】：石油作為能源被廣泛利用,但在石油開采、運輸及生產過程中對土壤環(huán)境產生的污染也是嚴重困擾人類的問題。污油的處理方法很多,包括物理、化學和生物等修復方法,其中生物修復以安全、經濟,無二次污染等優(yōu)點備受關注。但原油中組分復雜,污染土壤的生物修復難度也很大,尤其是石油中的芳香烴類成分更難被微生物所利用,因此,分離篩選原油降解微生物,研究其對原油組分的代謝特點,并采用轉錄組測序技術探討原油降解真菌的芳香烴降解相關基因表達,為今后芳香烴高效降解菌的篩選和開發(fā)提供技術支持,從而進一步提高原油污染的生物修復效率。 本研究從大慶油田地區(qū)長期油污土壤中分離得到了12株高效的原油降解真菌,通過菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、生理生化實驗及ITS序列對已分離真菌進行了鑒定,確定其近緣種屬：H1、H3、H9、X9與X12屬于鐮刀菌屬(Fusarium sp.);H2屬于土曲霉(Aspergillus terreus), H4屬于雅致放射毛霉(Actinomucor elegans),X1屬于植物內生菌(Fungal endophyte), X3屬于真菌菌株(Fungal sp.), X7屬于黃白生叢赤殼菌(Bionectria ochroleuca), X11屬于葡萄穗酶菌(Stachybotrys sp.),D4屬于木霉菌(Trichoderma atroviride)。 在液體培養(yǎng)條件下研究了pH、氮源和磷源對12種真菌菌絲干重的影響,結果發(fā)現(xiàn)12種原油降解真菌均在pH7.0時生長旺盛,獲得較高的菌絲干重,H9和X12真菌在以NH4NO3為氮源時生物量最高,H4真菌的最適氮源為NaNO3,其余9種原油降解真菌均以KNO3為氮源時達到最大平均菌絲干重。KH2PO4和K2HPO4/KH2PO4(1:2)雙磷源都能使12種真菌具有較高的生物量,且兩種磷源對菌絲生長影響不顯著。 影響真菌原油降解率的因素有很多,本文主要探討了培養(yǎng)條件、pH、N/P比值、NaCl濃度和原油濃度對12種原油降解真菌原油降解率的影響�？傮w來說,當pH、N/P比值、NaCl濃度確定時,真菌在液體培養(yǎng)條件下的原油降解率普遍高于土壤中的原油降解率。在pH7.0時多數真菌表現(xiàn)為最高降解率,在pH8.0～9.0時真菌也能維持較高的降解率。同時12種真菌的原油降解率隨NaCl濃度的升高而降低,但NaCl濃度為10%時X9和D4菌株還有20%以上的原油降解率,可以看出從大慶油污土壤中分離的原油降解真菌具有一定的耐鹽堿性,這與菌種對大慶地區(qū)的鹽堿土壤特質的適應性是相符的。12種真菌菌株中X1菌株在液體培養(yǎng)和土壤培養(yǎng)中都顯示出了最高的原油降解率。 真菌對石油烴類物質的降解代謝多數是從單加氧開始的,但在代謝過程中不同的菌種有多種復雜的酶系參與,本文對12種原油降解真菌在1%原油濃度下幾種主要降解相關氧化還原酶活性進行研究,探討真菌在原油降解過程中木質素過氧化物酶(Ligin Peroxidase,LiP)、錳過氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)和漆酶(Laccases,Lac)活力與原油降解率之間的關系。結果發(fā)現(xiàn),各菌株產酶種類和活力各不相同,除X12的LiP和H4的Lac的活性受原油的抑制外其余菌株的酶活性都能夠在原油的誘導下顯著升高。Lac的活性與真菌土壤條件原油降解率呈現(xiàn)極顯著正相關性；LiP活性與液體和土壤培養(yǎng)條件下原油降解率之間的相關系數均小于0.3；而MnP活性與原油降解率之間呈現(xiàn)負相關。 通過對能夠降解芳香烴的X1菌株的轉錄組測序、過濾和拼接后得到了34003個轉錄本,即Unigene,并在Nt、Nr、GO等7個數據庫中成功注釋了28660個基因片段。GO分類顯示與烷烴代謝相關的酶基因共16376個,其中在GO功能注釋中功能為氧化還原酶作用于CH-CH、氧化還原酶作用于雙酚及相關物質、氧化還原酶作用于CH-OH、轉移酶作用于酰基、轉移酶作用于烷基或芳基、碳-碳裂解的酶基因數量都相對較多。KEGG Pathway富集結果顯示X1菌株的基因集中在碳水化合物代謝途徑中的最多,有527個,占被注釋的基因總數的12.3%,并且其中細胞芳香化合物代謝和雜環(huán)代謝途徑中的基因數量顯著高于其他代謝途徑中的基因數量。 比較X1菌株在含茚的無機鹽培養(yǎng)基處理和PDA培養(yǎng)基非處理對照的基因表達水平,發(fā)現(xiàn)1216個上調基因中,在萘降解通路和氧化磷酸化通路中上調基因的比例最高,結合GO分類中比例較高的酶基因,預測茚的代謝可能與萘的代謝有極相似的過程。
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圖1-1大慶落地原油污染Figure 1-1 Crude oil pollution landing in Daqing許多研究表明，石油中含有大量的烴類物質，包括q<烴和芳香烴，尤其是其中的芳經(PAHs),具有很強的毒性，是典型致癌、致畸、致突變的“三致”成分，世生組織早已把16種PAHs作為環(huán)境監(jiān)測的重要對象，這些高分子量的復雜有機化

采用CTAB法對12種真菌的菌絲進行基因組DNA的提取，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2-3，12個真菌的基因組DNA樣品電泳條帶清晰、明亮，但點樣孔處較墜，可能存在蛋曰質等雜質，但經過OD260和OD28G的測定（表2-7)，OD26()/OD280比值均在1.8?2.2之間，OD260/OD230比值在2.0?2.4之間，，表明DNA的純度較好，含有的-19-
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X172;X53

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 譚麗泉;周煥清;;表面活性劑在微生物降解石油中的應用研究進展[J];化學與生物工程;2007年10期

2 賈建麗;李廣賀;;油田區(qū)土壤微生物種群構成及系統(tǒng)分類初步研究[J];環(huán)境科學;2009年04期

3 張學佳;紀巍;康志軍;孫大勇;王建;;土壤中石油類污染物的自然降解[J];石化技術與應用;2008年03期

本文編號：2669356