【摘要】：石油作為能源被廣泛利用,但在石油開采、運(yùn)輸及生產(chǎn)過程中對(duì)土壤環(huán)境產(chǎn)生的污染也是嚴(yán)重困擾人類的問題。污油的處理方法很多,包括物理、化學(xué)和生物等修復(fù)方法,其中生物修復(fù)以安全、經(jīng)濟(jì),無二次污染等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。但原油中組分復(fù)雜,污染土壤的生物修復(fù)難度也很大,尤其是石油中的芳香烴類成分更難被微生物所利用,因此,分離篩選原油降解微生物,研究其對(duì)原油組分的代謝特點(diǎn),并采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探討原油降解真菌的芳香烴降解相關(guān)基因表達(dá),為今后芳香烴高效降解菌的篩選和開發(fā)提供技術(shù)支持,從而進(jìn)一步提高原油污染的生物修復(fù)效率。 本研究從大慶油田地區(qū)長期油污土壤中分離得到了12株高效的原油降解真菌,通過菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及ITS序列對(duì)已分離真菌進(jìn)行了鑒定,確定其近緣種屬：H1、H3、H9、X9與X12屬于鐮刀菌屬(Fusarium sp.);H2屬于土曲霉(Aspergillus terreus), H4屬于雅致放射毛霉(Actinomucor elegans),X1屬于植物內(nèi)生菌(Fungal endophyte), X3屬于真菌菌株(Fungal sp.), X7屬于黃白生叢赤殼菌(Bionectria ochroleuca), X11屬于葡萄穗酶菌(Stachybotrys sp.),D4屬于木霉菌(Trichoderma atroviride)。 在液體培養(yǎng)條件下研究了pH、氮源和磷源對(duì)12種真菌菌絲干重的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)12種原油降解真菌均在pH7.0時(shí)生長旺盛,獲得較高的菌絲干重,H9和X12真菌在以NH4NO3為氮源時(shí)生物量最高,H4真菌的最適氮源為NaNO3,其余9種原油降解真菌均以KNO3為氮源時(shí)達(dá)到最大平均菌絲干重。KH2PO4和K2HPO4/KH2PO4(1:2)雙磷源都能使12種真菌具有較高的生物量,且兩種磷源對(duì)菌絲生長影響不顯著。 影響真菌原油降解率的因素有很多,本文主要探討了培養(yǎng)條件、pH、N/P比值、NaCl濃度和原油濃度對(duì)12種原油降解真菌原油降解率的影響。總體來說,當(dāng)pH、N/P比值、NaCl濃度確定時(shí),真菌在液體培養(yǎng)條件下的原油降解率普遍高于土壤中的原油降解率。在pH7.0時(shí)多數(shù)真菌表現(xiàn)為最高降解率,在pH8.0～9.0時(shí)真菌也能維持較高的降解率。同時(shí)12種真菌的原油降解率隨NaCl濃度的升高而降低,但NaCl濃度為10%時(shí)X9和D4菌株還有20%以上的原油降解率,可以看出從大慶油污土壤中分離的原油降解真菌具有一定的耐鹽堿性,這與菌種對(duì)大慶地區(qū)的鹽堿土壤特質(zhì)的適應(yīng)性是相符的。12種真菌菌株中X1菌株在液體培養(yǎng)和土壤培養(yǎng)中都顯示出了最高的原油降解率。 真菌對(duì)石油烴類物質(zhì)的降解代謝多數(shù)是從單加氧開始的,但在代謝過程中不同的菌種有多種復(fù)雜的酶系參與,本文對(duì)12種原油降解真菌在1%原油濃度下幾種主要降解相關(guān)氧化還原酶活性進(jìn)行研究,探討真菌在原油降解過程中木質(zhì)素過氧化物酶(Ligin Peroxidase,LiP)、錳過氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)和漆酶(Laccases,Lac)活力與原油降解率之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),各菌株產(chǎn)酶種類和活力各不相同,除X12的LiP和H4的Lac的活性受原油的抑制外其余菌株的酶活性都能夠在原油的誘導(dǎo)下顯著升高。Lac的活性與真菌土壤條件原油降解率呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性；LiP活性與液體和土壤培養(yǎng)條件下原油降解率之間的相關(guān)系數(shù)均小于0.3；而MnP活性與原油降解率之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。 通過對(duì)能夠降解芳香烴的X1菌株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、過濾和拼接后得到了34003個(gè)轉(zhuǎn)錄本,即Unigene,并在Nt、Nr、GO等7個(gè)數(shù)據(jù)庫中成功注釋了28660個(gè)基因片段。GO分類顯示與烷烴代謝相關(guān)的酶基因共16376個(gè),其中在GO功能注釋中功能為氧化還原酶作用于CH-CH、氧化還原酶作用于雙酚及相關(guān)物質(zhì)、氧化還原酶作用于CH-OH、轉(zhuǎn)移酶作用于�；⑥D(zhuǎn)移酶作用于烷基或芳基、碳-碳裂解的酶基因數(shù)量都相對(duì)較多。KEGG Pathway富集結(jié)果顯示X1菌株的基因集中在碳水化合物代謝途徑中的最多,有527個(gè),占被注釋的基因總數(shù)的12.3%,并且其中細(xì)胞芳香化合物代謝和雜環(huán)代謝途徑中的基因數(shù)量顯著高于其他代謝途徑中的基因數(shù)量。 比較X1菌株在含茚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基處理和PDA培養(yǎng)基非處理對(duì)照的基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)1216個(gè)上調(diào)基因中,在萘降解通路和氧化磷酸化通路中上調(diào)基因的比例最高,結(jié)合GO分類中比例較高的酶基因,預(yù)測(cè)茚的代謝可能與萘的代謝有極相似的過程。
【圖文】：

圖1-1大慶落地原油污染Figure 1-1 Crude oil pollution landing in Daqing許多研究表明，石油中含有大量的烴類物質(zhì)，包括q<烴和芳香烴，尤其是其中的芳經(jīng)(PAHs),具有很強(qiáng)的毒性，是典型致癌、致畸、致突變的“三致”成分，世生組織早已把16種PAHs作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要對(duì)象，這些高分子量的復(fù)雜有機(jī)化

采用CTAB法對(duì)12種真菌的菌絲進(jìn)行基因組DNA的提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2-3，12個(gè)真菌的基因組DNA樣品電泳條帶清晰、明亮，但點(diǎn)樣孔處較墜，可能存在蛋曰質(zhì)等雜質(zhì)，但經(jīng)過OD260和OD28G的測(cè)定（表2-7)，OD26()/OD280比值均在1.8?2.2之間，OD260/OD230比值在2.0?2.4之間，，表明DNA的純度較好，含有的-19-
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X172;X53

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 譚麗泉;周煥清;;表面活性劑在微生物降解石油中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];化學(xué)與生物工程;2007年10期

2 賈建麗;李廣賀;;油田區(qū)土壤微生物種群構(gòu)成及系統(tǒng)分類初步研究[J];環(huán)境科學(xué);2009年04期

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本文編號(hào)：2669356