異腈是一類同時具有親核和親電性質(zhì)的特殊化學(xué)基團(tuán),含有異腈基團(tuán)的天然產(chǎn)物一般都具有生物活性。從第一例異腈天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)到2016年的70年間,總共只有約200個異腈天然產(chǎn)物被分離鑒定,而其中雙異腈化合物的數(shù)量更是非常少。經(jīng)不完全統(tǒng)計,到2020年2月為止只有不超過10個雙異腈天然產(chǎn)物的母核被報道。由于這些化合物具有如抑菌、金屬螯合、抗瘧和細(xì)胞毒性等生物活性,對它們的生物合成及作用機(jī)制進(jìn)行研究在理解微生物的行為、微生物與環(huán)境互作和藥物設(shè)計等方面是具有積極的意義的。課題組前期從硫藤黃鏈霉菌中成功克隆到一個雙異腈天然產(chǎn)物SF2768的生物合成基因簇,通過分子生物學(xué)和天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定等手段推測了其生物合成途徑,同時證明了SF2768能特異性結(jié)合銅離子并以復(fù)合物的形式進(jìn)入細(xì)胞。本文基于前期工作,對SF2768生物合成途徑中的酶進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。通過體外重建生物合成途徑,我們成功地利用四個生物合成酶Sfa B,Sfa C,Sfa D和Sfa E在體外合成了具有異戊�；鶄�(cè)鏈的SF2768類似物,確定了SF2768骨架的合成機(jī)制;同時通過化學(xué)衍生化捕獲了反應(yīng)途徑中的醛中間體,確認(rèn)了所推測的合成途徑的正確...

【文章頁數(shù)】：163 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語
第一章 前言
    1.1 雙異腈類天然產(chǎn)物研究進(jìn)展
        1.1.1 Xanthocillin相關(guān)研究進(jìn)展
        1.1.2 Hazimycin相關(guān)研究進(jìn)展
        1.1.3 雙異腈萜類相關(guān)報道
        1.1.4 雙異腈多元醇衍生物研究進(jìn)展
        1.1.5 異腈脂肽研究進(jìn)展
    1.2 異腈類天然產(chǎn)物合成與降解機(jī)制的研究進(jìn)展
        1.2.1 異腈天然產(chǎn)物生物合成研究進(jìn)展
        1.2.2 異腈生物降解的第一步—水合
        1.2.3 異腈生物降解的第二步—酰胺水解
    1.3 本研究的目的和意義
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 引物序列
        2.1.3 生化試劑
        2.1.4 儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 常規(guī)微生物學(xué)和分子生物學(xué)操作
        2.2.2 化合物的發(fā)酵檢測和分離純化
        2.2.3 Sfa B-Sfa E的體外反應(yīng)
        2.2.4 SfaB的酶學(xué)實驗
        2.2.5 SfaF的體外和點(diǎn)突變實驗
        2.2.6 鉻天青顯色實驗
        2.2.7 SF2768酸水解實驗
        2.2.8 SfaD底物偏好性實驗
        2.2.9 SF2768-Cu復(fù)合物生物活性測定
        2.2.10 ICP-MS檢測銅離子豐度實驗
        2.2.11 胞內(nèi)ATP豐度檢測
        2.2.12 活性氧檢測實驗
        2.2.13 酪氨酸酶抑制實驗
第三章 通過體外重建揭示SF2768的生物合成途徑
    3.1 前言
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 SF2768非異腈類似物的分離與鑒定
        3.2.2 SF2768非異腈類似物的體外合成
        3.2.3 反應(yīng)體系中醛中間體的捕捉
        3.2.4 基于腺苷化酶底物寬泛性的天然產(chǎn)物多樣化
        3.2.5 對異腈基團(tuán)生物合成的探索
    3.3 討論
第四章 SF2768的自抗性及降解途徑的研究
    4.1 前言
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 發(fā)酵液中水合類似物的分離鑒定
        4.2.2 異腈水合酶SfaF的發(fā)現(xiàn)
        4.2.3 異腈水合酶Sfa F體外對SF2768 活性的影響
        4.2.4 異腈水合酶SfaF體外產(chǎn)物的分離鑒定
        4.2.5 異腈水合酶SfaF活性位點(diǎn)及動力學(xué)分析
        4.2.6 SF2768及其水合產(chǎn)物結(jié)合銅離子的能力的測定
    4.3 討論
第五章 SF2768通過活性氧來發(fā)揮抑菌作用
    5.1 前言
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 SF2768類似物的分離與結(jié)對構(gòu)型的鑒定
        5.2.2 SF2768的抑菌活性可被銅離子消除
        5.2.3 SF2768抑菌機(jī)理的推測
        5.2.4 SF2768功能的總結(jié)
    5.3 討論
第六章 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
博士期間發(fā)表文章
致謝
附錄
    第三章 附錄
    第四章 附錄
    第五章 附錄



本文編號：3792859