論文的第一部分闡述了釀酒酵母減數(shù)分裂過程中,聯(lián)會復合體的側向元件Hopl與Mekl相互作用的結構與功能研究。減數(shù)分裂是一種特殊的細胞分裂方式,是有性生殖不可缺少的環(huán)節(jié)。減數(shù)分裂的正常進行對于維持物種染色體數(shù)目的穩(wěn)定及產(chǎn)生多樣性的后代十分重要。減數(shù)分裂前期Ⅰ過程中的同源重組是實現(xiàn)來自父本和母本基因信息交換的重要過程。同源重組的順利進行需要聯(lián)會復合體的參與以實現(xiàn)其一系列生物學行為的精確調(diào)控。聯(lián)會復合體的結構組分Hopl通過其SCD結構域318位蘇氨酸磷酸化與減數(shù)分裂特異性激酶Mekl FHA結構域的相互作用來實現(xiàn)后者的定位與激活。激活的Mekl磷酸化一系列底物使得同源重組過程中修復模板的選擇傾向于同源染色體的非姐妹染色單體,從而實現(xiàn)減數(shù)分裂的同源重組及后續(xù)行為的正常進行。認知Mekl-FHA如何識別Hopl pT318對于深入理解Mekl的定位與激活十分重要。本文展示了釀酒酵母Mekl-FHA的單體及與Hopl pT318小肽復合物的晶體結構。通過分析Mekl-FHA和PDB中已有的FHA結構域,我們提出一類位于結合口袋處的PSXS Motif。此類Motif在三維結構和底物識別模式上具有... 

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 釀酒酵母Mek1與Hop1相互作用的結構與功能研究
    1.1 背景介紹
        1.1.1 引言
        1.1.2 減數(shù)分裂前期Ⅰ的染色體行為
        1.1.3 同源染色體間的配對、聯(lián)會和重組
        1.1.4 聯(lián)會復合體
        1.1.5 線性元件
        1.1.6 聯(lián)會復合體側向元件Hop1的組裝與功能
        1.1.7 減數(shù)分裂特異性激酶Mek1
        1.1.8 FHA結構域的結構特點
        1.1.9 FHA結構域的底物識別特點
        1.1.10 FHA結構域介導的磷酸化非依賴性的相互作用
        1.1.11 總結
    1.2 實驗材料與方法
        1.2.1 釀酒酵母及裂殖酵母Mek1 FHA結構域的基因獲取
        1.2.2 目的基因片段回收
        1.2.3 目的基因片段的雙酶切實驗
        1.2.4 質粒的改造提取及線性化
        1.2.5 重組質粒的構建
        1.2.6 感受態(tài)細胞的制備
        1.2.7 連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞
        1.2.8 單克隆的鑒定與測序
        1.2.9 突變體的構建
        1.2.10 Mek1 FHA結構域的表達
        1.2.11 6×His標簽融合蛋白質的純化
        1.2.12 GST標簽蛋白質的親和純化
        1.2.13 重組蛋白質的TEV酶切
        1.2.14 蛋白質的精細純化-AKTA系統(tǒng)分子篩
        1.2.15 蛋白質的精細純化-AKTA系統(tǒng)離子交換
        1.2.16 SDS-PAGE蛋白質電泳
        1.2.17 等溫滴定量熱實驗
        1.2.18 蛋白質晶體的生長、數(shù)據(jù)收集及結構解析
        1.2.19 蛋白質的圓二色光譜
    1.3 實驗結果
        1.3.1 釀酒酵母和裂殖酵母Mek1 FHA結構域的重組表達
        1.3.2 體外鑒定釀酒酵母Mek1-FHA對Hop1 pThr318的優(yōu)先選擇性
        1.3.3 釀酒酵母Mek1-FHA單體及與Hop1 pThr318復合物晶體結構
        1.3.4 釀酒酵母Mek1-FHA與Hop1 pThr318的相互作用細節(jié)
        1.3.5 Mek1-FHA對Hop1 pThr318的pT+2和pT+3的特異性相互作用
        1.3.6 Mek1-FHA的結構特點及其PSXS Motif
        1.3.7 釀酒酵母Mek1-FHA結合底物的鑒定
        1.3.8 裂殖酵母Mek1-FHA結合底物的鑒定
    1.4 討論
        1.4.1 釀酒酵母Mek1 FHA結構域結合底物的特異性
        1.4.2 FHA結構域介導的非傳統(tǒng)的相互作用
        1.4.3 釀酒酵母和裂殖酵母Mek1激酶活性的調(diào)控機制
    1.5 課題總結與展望
        1.5.1 釀酒酵母Hop1 SCD上多磷酸化位點與Mek1-FHA的相互作用
        1.5.2 釀酒酵母Mek1激酶激活機制的研究
        1.5.3 裂殖酵母Mek1 pThr15和Hop1 pThr270功能探索
第2章 海環(huán)桿菌去乙酰化酶CmCBDA結構與功能的研究
    2.1 背景介紹
        2.1.1 骨關節(jié)炎的特點及其預防與治療
        2.1.2 葡萄糖胺在骨關節(jié)炎預防與治療中的作用
        2.1.3 葡萄糖胺的需求與生產(chǎn)工藝探索
        2.1.4 葡萄糖胺的工業(yè)化生產(chǎn)流程
        2.1.5 CmCBDA的鑒定和酶活特點
        2.1.6 Ydjc家族的研究進展
        2.1.7 總結
    2.2 實驗材料與方法
        2.2.1 目的基因的合成與優(yōu)化
        2.2.2 CmCBDA的克隆表達與純化
        2.2.3 晶體的初步篩選
        2.2.4 衍射數(shù)據(jù)的收集和處理
    2.3 實驗結果與討論
        2.3.1 CmCBDA的全長表達
        2.3.2 CmCBDA的晶體結構描述
        2.3.3 酶活口袋的細節(jié)描述
        2.3.4 Ydjc家族成員的序列比對結果
        2.3.5 CmCBDA的同源性搜索
        2.3.6 CmCBDA對乙酰葡萄糖胺選擇性識別的初步闡述
    2.4 總結與展望
參考文獻
附錄1
附錄2
致謝
在讀期間發(fā)表的學術論文與參加的學術會議



本文編號：3727398