中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary,CHO）已是應(yīng)用最為廣泛的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)治療性生物制品的CHO工程細(xì)胞系一直是研究工作的熱點(diǎn)。課題組前期組合應(yīng)用慢病毒示蹤報(bào)告基因及染色體步移技術(shù),在CHO-K1基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)6個(gè)可持續(xù)表達(dá)報(bào)告基因的位點(diǎn)。本研究對(duì)其中一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了表達(dá)穩(wěn)定性的驗(yàn)證工作,并分別實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）基因和人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）基因在該位點(diǎn)的定點(diǎn)整合和穩(wěn)定表達(dá)。一、以整合了Zs Green1報(bào)告基因的CHO-K1-ZsGreen1-2C6細(xì)胞為研究材料,組合使用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù),定量分析了ZsGreen1報(bào)告基因的表達(dá)情況。按照主細(xì)胞庫(kù)到2000 L細(xì)胞生產(chǎn)罐放大培養(yǎng)的細(xì)胞代次需求,連續(xù)傳代培養(yǎng)50代次,發(fā)現(xiàn)100%的CHO-K1-Zs Green1-2C6貼壁和懸浮細(xì)胞均可穩(wěn)定表達(dá)ZsGreen1報(bào)告基因,提示CHO-K1細(xì)胞LOC103162981基因NW＿003626341.1內(nèi)第1689堿基（... 

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 工程細(xì)胞簡(jiǎn)介
        1.1.1 常用的工程細(xì)胞
        1.1.2 CHO細(xì)胞簡(jiǎn)介
    1.2 CHO工程細(xì)胞的構(gòu)建
        1.2.1 CHO細(xì)胞的表達(dá)優(yōu)勢(shì)
        1.2.2 CHO工程細(xì)胞構(gòu)建的傳統(tǒng)方法
        1.2.3 CHO工程細(xì)胞的存在問題
    1.3 CHO工程細(xì)胞的研究進(jìn)展
        1.3.1 抗凋亡工程
        1.3.2 基因位點(diǎn)特異性整合
    1.4 本文研究背景和研究?jī)?nèi)容
        1.4.1 研究背景
        1.4.2 研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞株和菌株
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 主要試劑及溶液
        2.1.6 儀器和設(shè)備
        2.1.7 分析軟件
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與保藏
        2.2.2 MTT法檢測(cè)CHO-K1-ZsGreen1-2C6 貼壁細(xì)胞的倍增時(shí)間
        2.2.3 倒置熒光顯微鏡觀察ZsGreen1 蛋白表達(dá)情況
        2.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度
        2.2.5 Zsgreen1 蛋白轉(zhuǎn)錄水平分析
        2.2.6 sgRNA設(shè)計(jì)與質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.7 sgRNA可編輯性驗(yàn)證
        2.2.8 供體質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
        2.2.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和單克隆篩選
        2.2.10 目的基因定點(diǎn)整合的鑒定
        2.2.11 目的蛋白質(zhì)的表達(dá)鑒定
        2.2.12 目的蛋白細(xì)胞表達(dá)水平的檢測(cè)
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
    3.2 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1 報(bào)告基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
        3.2.1 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 貼壁細(xì)胞內(nèi)ZsGreen1 基因的表達(dá)情況
        3.2.2 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 懸浮細(xì)胞內(nèi)ZsGreen1 基因的表達(dá)情況
        3.2.3 不同代次CHO-K1-ZsGreen1-2C6 細(xì)胞內(nèi)ZsGreen1 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)
    3.3 sgRNA質(zhì)粒的驗(yàn)證及陽(yáng)性克隆篩選
    3.4 sgRNA編輯效率驗(yàn)證
    3.5 定點(diǎn)整合基因的鑒定
        3.5.1 定點(diǎn)整合EGFP基因細(xì)胞株的鑒定
        3.5.2 定點(diǎn)整合HSA基因細(xì)胞株的鑒定
    3.6 目的蛋白表達(dá)的鑒定
        3.6.1 EGFP基因表達(dá)的鑒定
        3.6.2 HSA基因表達(dá)的鑒定
    3.7 EGFP報(bào)告基因的表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
    3.8 HSA基因表達(dá)水平檢測(cè)
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中兩種gRNA活性檢測(cè)方法比較[J]. 劉燕,任衛(wèi)紅,王綠婭,張曉萍,高詩(shī)娟,武威,李鳳娟,杜杰.  心肺血管病雜志. 2016(07)
[2]提高哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞抗凋亡能力的基因策略[J]. 徐洪記,張兵兵.  中國(guó)生物工程雜志. 2012(06)

博士論文
[1]CHO細(xì)胞定點(diǎn)整合穩(wěn)定表達(dá)治療性蛋白質(zhì)的研究[D]. 周松濤.江南大學(xué) 2019



本文編號(hào)：3727545