CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一項(xiàng)基因定點(diǎn)編輯技術(shù),但對(duì)特定CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的編輯效率進(jìn)行有效評(píng)估的方法仍十分匱乏,本研究的目的是建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便測(cè)定CRISPR/Cas9基因編輯效率的方法。在我們的方法中,將與種子專一表達(dá)啟動(dòng)子（2S3）連接的mCherry熒光蛋白報(bào)告基因作為選擇基因,并以編碼脂肪酸脫氫酶FAD2的基因?yàn)榘行蛄?然后對(duì)經(jīng)CRISPR/Cas9編輯的擬南芥種子進(jìn)行脂肪酸組分分析,根據(jù)其組分變化計(jì)算該方法的編輯效率。結(jié)果顯示,利用mCherry熒光蛋白報(bào)告基因的種子專一表達(dá)特性,可簡(jiǎn)便快速地篩選陽性的初級(jí)轉(zhuǎn)化子和后代的無轉(zhuǎn)基因突變子;而種子油脂分析法能快速、準(zhǔn)確地鑒定CRISPR/Cas9編輯的突變體,可以精確地檢測(cè)出核酸長(zhǎng)度小至單個(gè)堿基對(duì)的突變,用該方法獲得的CRISPR/Cas9基因編輯效率（54.5%～74.1%）遠(yuǎn)高于基于聚丙烯酰氨凝膠電泳法獲得的編輯效率（3.7%～15.4%）。說明,該方法檢測(cè)CRISPR/Cas9基因編輯效率的高效性與可行性。 

【文章來源】：江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2020,36(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

用于快速檢測(cè)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)編輯效率的雙元載體質(zhì)粒圖譜

將編輯基因載體轉(zhuǎn)化到擬南芥獲得T1代種子后,使用體式熒光顯微鏡篩選轉(zhuǎn)基因陽性種子,篩選結(jié)果如圖2所示。在藍(lán)色激發(fā)光下顯示紅色熒光的種子表示有mCherry熒光蛋白報(bào)告基因轉(zhuǎn)入,即為陽性植株。2.2 CRISPR/Cas9基因編輯效率檢測(cè)

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法,對(duì)熒光篩選獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行突變與否的鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果(圖3)顯示,不具有野生型對(duì)照條帶的為純合突變植株,既有突變條帶又有野生型對(duì)照條帶的為雜合突變植株,只有野生型對(duì)照條帶的則為未突變植株。對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)從而確定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率。如表2所示,4次試驗(yàn)的編輯效率分別為15.4%、9.1%、3.7%、4.0%。


本文編號(hào)：3397880