目的:細菌外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVs）含有大量的細菌性抗原并具有佐劑作用,能夠有效地激活免疫系統(tǒng),被譽為極具潛力的疫苗候選;當前,鮑曼不動桿菌引起的院內(nèi)感染備受關注,多重耐藥鮑曼不動桿菌更被視為“監(jiān)護室的噩夢”,對住院病人構成極大威脅,也給醫(yī)院內(nèi)感染的控制帶來了困難。本課題旨在分離鮑曼不動桿菌的OMVs,分析其對在天然和適應性免疫應答中均發(fā)揮重要作用的樹突狀細胞的調(diào)節(jié)作用,探討鮑曼不動桿菌OMVs作為疫苗的作用機制及其用于防控鮑曼不動桿菌感染的可能性。方法:（1）鮑曼不動桿菌外膜囊泡的分離提取:常規(guī)培養(yǎng)細菌并經(jīng)差速離心法分離細菌外膜囊泡,通過透射電鏡分析、SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色等相關方法進行細菌外膜囊泡鑒定。（2）細菌外膜囊泡刺激濃度的確定:將分離的細菌外膜囊泡進行系列稀釋,取不同濃度的外膜囊泡處理髓源性樹突狀細胞,MTT法檢測細胞的存活率,以不影響樹突狀細胞存活率的最高細菌囊泡用量確定為擬用刺激濃度（10μg/mL）。（3）鮑曼不動桿菌外膜囊泡刺激的髓源樹突狀細胞功能分析:經(jīng)確定濃度的（10μg/mL）外膜囊泡處理髓源性樹突狀... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

細菌外膜囊泡結構[33]

鮑曼不動桿菌OMVs調(diào)控樹突狀細胞參與抗感染的作用及機制6T細胞活化、促進B細胞增殖并分泌無關抗體等作用，這些作用將抑制宿主免疫功能，促進細菌的生存與發(fā)展。因此，使用合適的技術或方法來修飾細菌外膜囊泡從而使之發(fā)揮有效的免疫保護作用，是細菌外膜囊泡研究的關鍵。同時，由于不同細菌外膜囊泡產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用的非均一性和復雜性，給細菌外膜囊泡的疫苗研究提出了挑戰(zhàn)。然而，細菌外膜囊泡的佐劑效應，卻激發(fā)了外膜囊泡疫苗研究的興趣和希望。圖1.2細菌外膜囊泡的抗原提呈給免疫細胞的模式圖[33]Figure1.2Amodelforoutermembranevesiclesantigenpresentationtoimmunecells[33]1.3.4細菌外膜囊泡的臨床應用前景對于免疫細胞來說，細菌外膜囊泡屬于外來的異物。因此，宿主體內(nèi)的免疫細胞會快速對其作出響應，包括巨噬細胞的吞噬清除、相關固有免疫細胞分泌炎癥因子和趨化因子[73-75]。大量文獻報道，細菌外膜囊泡免疫小鼠后會刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對外膜囊泡的特異性抗體，這種適應性免疫應答的產(chǎn)生，對于宿主抗病原體感染具有重要的現(xiàn)實意義[76-78]。就目前的研究與應用現(xiàn)狀而言，除了基于腦膜炎奈瑟菌外膜囊泡研制的疫苗被應用于人體治療實踐，并取得了良好的治療效果外[76]，其它各種細菌外膜囊泡由于自身存在的多種局限性，并未應用于人體感

鮑曼不動桿菌OMVs調(diào)控樹突狀細胞參與抗感染的作用及機制85使用ELISA檢測技術和PCR技術檢測外膜囊泡處理后髓源性樹突狀細胞分泌功能和相關細胞因子的mRNA表達情況。6使用磁珠分選技術和流式細胞技術檢測外膜囊泡處理后的髓源性樹突狀細胞對初始T細胞增殖分化的影響。圖1.3體外實驗Figure1.3Experimentinvitro（2）體內(nèi)實驗部分（圖1.4）：第一部分，按照實驗流程對小鼠進行外膜囊泡的免疫，每周一次共三次，最后一次免疫后三天斷頸處死小鼠后，取出脾臟進行研磨，通過流式細胞術和ELISA檢測技術進行相關指標的檢測分析。第二部分，分別以不同濃度的鮑曼不動桿菌尾靜脈注射進入小鼠體內(nèi)，監(jiān)測小鼠的生存情況，從而確定合適的感染濃度。第三部分，使用兩種不同的外膜囊泡分別免疫小鼠，每周一次共三周。于第四周，分別尾靜脈注射合適濃度的鮑曼不動桿菌，監(jiān)測小鼠的生存情況，繪制生存曲線。


本文編號：3398037