微生物油脂因其具有生產(chǎn)周期短、可連續(xù)生產(chǎn)、可規(guī)�；米匀唤缲S富資源和脂肪酸組成易通過(guò)基因工程手段進(jìn)行改造等特點(diǎn),是第三代生物柴油重要的原料來(lái)源。實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了微生物油脂生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）CT14,本課題在此基礎(chǔ)上進(jìn)行系統(tǒng)代謝工程改造,進(jìn)一步研究和探索微生物油脂合成及調(diào)控機(jī)制。首先,強(qiáng)化前體之一3-磷酸甘油的供給。C.glutamicum CT14只強(qiáng)化了脂肪酸的供給,大量脂肪酸溢出胞外造成浪費(fèi)。為了平衡合成甘油三酯（TAG）兩種前體物質(zhì)的供給,減少胞外游離脂肪酸的含量,對(duì)前體3-磷酸甘油合成途徑進(jìn)行了調(diào)控。涉及到的基因有g(shù)lpD、gpsA和gpp,通過(guò)發(fā)酵分析比較單個(gè)基因以及三個(gè)基因不同串聯(lián)組合表達(dá)對(duì)菌株胞內(nèi)外脂肪酸和微生物油脂合成的影響,獲得最優(yōu)的基因組合改造策略,過(guò)表達(dá)gpsA并敲除基因glpD,菌株胞外游離脂肪酸基本為零,總脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到1.8 g/L,甘油三酯（TAG）含量有5～10%的提高。其次,強(qiáng)化TAG合成限速步驟。文獻(xiàn)表明,谷氨酸棒桿菌的基因組中沒(méi)有明確標(biāo)注的GPAT功能基因。本課題對(duì)谷氨酸棒桿菌TAG合成途... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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圖１．２谷氨酸棒桿菌ＡＴＣＣ１３０３２Ｉ３７丨??

■?Ｍｕｔａｎｔ?ＩｄｈＡ??＜Ａ）?］?＜ｃＴ＾＞－???????￣￣￣?ＩＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ??、￣＾??Ｇｒｏｗｔｈ?ｏｎ?ＢＴ?ｍｅｄｉｕｍ?（Ａ）?ｒｅｇｉｏｎ?（Ｃ）?ｒｅｇｉｏｎ??ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?１０％?ｓｕｃｒｏｓｅ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ??？?、???ｊ?（Ａ）?ｉ??ｉ?ｉ?（ｂｉ?ｉ?￣｜ｊｃｒ＾＞??Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ?ＩｄｈＡ?ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ?Ｗｉｌｄ?ｒｙｐ＾??圖２．１基因無(wú)痕敲除過(guò)程ｌ？ｌ??Ｆｉｇ．２．１?Ｍａｒｋｅｒ－ｌｅｓｓ?ｇｅｎｅ?ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ??具體操作如下：以本論文中ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２７７７質(zhì)粒為例??ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２７７７敲除質(zhì)粒構(gòu)建??（１）以Ｃ．ｇ／論ｍ／ｈ／ｍＡＴＣＣ?１３０３２基因組為模板，使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，??用引物ｃｇ２７７７－Ｄｌ／Ｄ２擴(kuò)增基因ｃｇ２７７７的上游片段，用引物ｃｇ２７７７－Ｄ３／Ｄ４擴(kuò)增基因??ｃｇ２７７７下游片段，上下游片段大�。担埃�?ｂｐ左右；??（２）兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物含有２０?ｂｐ左右的同源序列，再將上下游ＰＣＲ產(chǎn)物段按摩爾比??１：１混合作為重疊ＰＣＲ的模板，用引物ｃｇ２７７７－Ｄｌ／Ｄ４進(jìn)行重疊ＰＣＲ擴(kuò)增，得到重疊片??段；?．??（３）引物對(duì)ｃｇ２７７７－Ｄｌ／Ｄ４分別含有處ａｌ和幼／Ｉ限制酶酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶??處〇１和幼／Ｉ將融合片段及質(zhì)粒ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ酶切純化，將酶切片段和載體以合適濃度??Ｔ４連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂布在藍(lán)白斑篩選平板上；??（４）菌落

。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，引物ＧＣ含量設(shè)計(jì)在４０％？６０％之間，退火溫度不易??過(guò)低且每條引物退火溫度相差不能太大。??（２）基因ｇ／ｐＺ）上下游同源臂的融合??以Ｃ：?ｇ／＿ｗ／ｃ臓ＡＴＣＣ１３０３２基因組為模板，用ＮＥＢ的熱啟動(dòng)Ｔａｑ聚合酶驗(yàn)證ＰＣＲ??條件然后用Ｐｈｕｓｉｏｎ高保真酶大量擴(kuò)增片段。用引物ｇｌｐ－Ｄｌ和ｇｌｐ－Ｄ２擴(kuò)增基因ｇ／ｐＤ的??上游片段ｇｌｐＤ－Ｕ大小是５０５?ｂｐ，用引物ｇｌｐ－Ｄ３和ｇｌｐ－Ｄ４擴(kuò)增基因ｇ／ｐＺ）的下游片段??ｇｌｐＤ－Ｄ大小是５４４ｂｐ?（見下圖３．２左）。將上下游片段切膠回收后作為模再利用引物對(duì)??§１卩－〇１／〇４來(lái)擴(kuò)增上下游融合片段１０３２?５口（見下圖３．２右）。???＾???（Ｊ１－？ｄ２?ｄ３＾ｄ４?ｅｘＵｅｘ２?ａｘ３＋ｅｘ４?ｄｌ？ｄ２?ｄ３＋＜Ｊ４?ａｌｐＤ?＇?＂＂?ａｏｓＡ．?Ｑｐｐ?’??ｄＨ＜Ｊ４?ｅｘＨｅｘ４?ｄ１？ｄ４?，??－?＇?Ｙ＇?＇?＂Ｗｍ＇??ｒ?一、．‘．?＇：?．…?－１．５??ｉ．〇？…?一ｔａｗ?——１°??Ｗ?＾?一―?一一一—一—?肩?＇?”?一?一０．５??圖３．２妳Ｚ）基因上下游同源臂重疊ＰＣＲ??Ｆｉｇ．３．２?Ｔｈｅ?ｆｕｓｉｏｎ?ＰＣＲ?ｏｆ?ｇｌｐＤ－Ｕ?ａｎｄ?ｇｌｐＤ－Ｄ??（３）?ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｇ丨ｐＤ敲除載體構(gòu)建??將重疊ＰＣＲ產(chǎn)物片段ｇｌｐＤ－Ｕｌ）和敲除質(zhì)粒ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ使用ＮＥＢ的限制性內(nèi)切??酶五ｃｏＲ丨和執(zhí)〃？ｉＨＮ雙酶切后在去磷酸化，經(jīng)過(guò)純化試劑盒純化后Ｔ４酶過(guò)夜連接轉(zhuǎn)化??大腸桿菌感受態(tài)，利用驗(yàn)證引物對(duì)ＰＫ１８－Ｔ１／


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