目的利用氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞進(jìn)行紅系定向分化的特點,構(gòu)建細(xì)胞模型;借助該模型,探討mi R-196a對紅細(xì)胞凋亡的影響及其發(fā)生機(jī)制。方法K562細(xì)胞經(jīng)氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)后,采用QPCR定量分析細(xì)胞γ-globin和CD235a的含量,同時用聯(lián)苯胺染色實驗定性分析細(xì)胞誘導(dǎo)后血紅蛋白的表達(dá)情況。構(gòu)建mi R-196a模擬物和mi RNA小發(fā)卡陰性對照物（mi RNA-Sh NC）的載體,與病毒包裝后轉(zhuǎn)染入氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞中,建立相應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞株并驗證。隨后用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖率,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡率的變化,并結(jié)合Western blotting的方法檢測一些與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的蛋白的表達(dá)。再利用生物信息學(xué)方法預(yù)測mi R-196a的靶基因,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸υ摪谢蜻M(jìn)行驗證,最后過表達(dá)該靶基因后分析細(xì)胞增殖及凋亡情況。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果K562細(xì)胞在25μM氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)24 h后,γ-globin、CD235a及聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞均較對照組增多,即能夠成功向紅系分化。過表達(dá)mi R-196a... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

利用25μM氯化高鐵血紅素作用24小時，可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向早期紅系分化

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文343.2過表達(dá)miR-196a促進(jìn)氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)染miR-196amimics后，miR-196a的相對表達(dá)較對照組明顯上調(diào)（圖2A）。CCK-8分析結(jié)果顯示，miR-196amimics組與對照細(xì)胞組（miRNA-ShNC組和空白對照組）相比，顯著提高了氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞的存活率（圖2B）。細(xì)胞周期分析顯示，與對照組相比，miR-196amimics組處于G0/G1期的細(xì)胞占比較少，而在S期和G2/M期則明顯偏多。這意味著miR-196amimics組中，從G0/G1期過渡到S期的細(xì)胞比對照組多（圖2C）。由此可見，miR-196a促進(jìn)了氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞的增殖，并加速了其從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)變。圖2.miR-196a過表達(dá)對氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的影響。（A）RT-PCR檢測miR-196a在miR-196amimics和miRNA-ShNC轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá)。（B）CCK-8法檢測細(xì)胞增殖。（C）用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每次處理一式三份，全部實驗重復(fù)三次。*p<0.05，**p<0.01�？瞻讓φ�，系無miRNA轉(zhuǎn)染的陰性對照。miRNA-ShNC，microRNA小發(fā)夾陰性對照。

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文353.3miR-196a過表達(dá)抑制氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡將miR-196amimics及miRNA-ShNC分別轉(zhuǎn)染氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞，再用AnnexinV/PI雙染法標(biāo)記細(xì)胞，其凋亡檢測結(jié)果顯示miR-196amimics組細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組(圖3A，3B)。此外，還檢測了一些凋亡蛋白，如Bax和Bcl-2[21]。蛋白印跡結(jié)果顯示miR-196a的過度表達(dá)下調(diào)了Bax的表達(dá)，但上調(diào)了Bcl-2的表達(dá)（圖3C）�？傊@些結(jié)果提示過表達(dá)miR-196a可抑制氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。圖3.過表達(dá)miR-196a對氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的影響。（A,B）將miR-196amimics及miRNA-ShNC分別轉(zhuǎn)染氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)后的K562細(xì)胞中，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率�？瞻捉M系無處理組。（C）以β-actin為內(nèi)參，檢測miR-196amimics及miRNA-ShNC分別轉(zhuǎn)染氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞的Bax和Bcl-2蛋白水平。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每次處理一式三份，全部實驗重復(fù)三次。*p<0.05�？瞻讓φ�，系無miRNA轉(zhuǎn)染的陰性對照。miRNA-ShNC，microRNA小發(fā)夾陰性對照。


本文編號：3330854