目的利用氯化高鐵血紅素誘導K562細胞進行紅系定向分化的特點,構建細胞模型;借助該模型,探討mi R-196a對紅細胞凋亡的影響及其發(fā)生機制。方法K562細胞經(jīng)氯化高鐵血紅素誘導后,采用QPCR定量分析細胞γ-globin和CD235a的含量,同時用聯(lián)苯胺染色實驗定性分析細胞誘導后血紅蛋白的表達情況。構建mi R-196a模擬物和mi RNA小發(fā)卡陰性對照物（mi RNA-Sh NC）的載體,與病毒包裝后轉染入氯化高鐵血紅素誘導K562細胞中,建立相應的穩(wěn)定轉導細胞株并驗證。隨后用CCK-8法檢測細胞的增殖率,用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率的變化,并結合Western blotting的方法檢測一些與細胞周期和凋亡相關的蛋白的表達。再利用生物信息學方法預測mi R-196a的靶基因,雙熒光素酶報告基因實驗對該靶基因進行驗證,最后過表達該靶基因后分析細胞增殖及凋亡情況。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。結果K562細胞在25μM氯化高鐵血紅素誘導24 h后,γ-globin、CD235a及聯(lián)苯胺染色陽性細胞均較對照組增多,即能夠成功向紅系分化。過表達mi R-196a... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學安徽省

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

利用25μM氯化高鐵血紅素作用24小時，可誘導K562細胞向早期紅系分化

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文343.2過表達miR-196a促進氯化高鐵血紅素誘導K562細胞的增殖轉染miR-196amimics后，miR-196a的相對表達較對照組明顯上調（圖2A）。CCK-8分析結果顯示，miR-196amimics組與對照細胞組（miRNA-ShNC組和空白對照組）相比，顯著提高了氯化高鐵血紅素誘導K562細胞的存活率（圖2B）。細胞周期分析顯示，與對照組相比，miR-196amimics組處于G0/G1期的細胞占比較少，而在S期和G2/M期則明顯偏多。這意味著miR-196amimics組中，從G0/G1期過渡到S期的細胞比對照組多（圖2C）。由此可見，miR-196a促進了氯化高鐵血紅素誘導K562細胞的增殖，并加速了其從G0/G1期向S期的轉變。圖2.miR-196a過表達對氯化高鐵血紅素誘導K562細胞的增殖和細胞周期轉換的影響。（A）RT-PCR檢測miR-196a在miR-196amimics和miRNA-ShNC轉染后細胞中的表達。（B）CCK-8法檢測細胞增殖。（C）用流式細胞儀分析細胞周期。所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。每次處理一式三份，全部實驗重復三次。*p<0.05，**p<0.01。空白對照，系無miRNA轉染的陰性對照。miRNA-ShNC，microRNA小發(fā)夾陰性對照。

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文353.3miR-196a過表達抑制氯化高鐵血紅素誘導K562細胞凋亡將miR-196amimics及miRNA-ShNC分別轉染氯化高鐵血紅素誘導K562細胞，再用AnnexinV/PI雙染法標記細胞，其凋亡檢測結果顯示miR-196amimics組細胞凋亡率明顯低于對照組(圖3A，3B)。此外，還檢測了一些凋亡蛋白，如Bax和Bcl-2[21]。蛋白印跡結果顯示miR-196a的過度表達下調了Bax的表達，但上調了Bcl-2的表達（圖3C）。總之，這些結果提示過表達miR-196a可抑制氯化高鐵血紅素誘導K562細胞的凋亡。圖3.過表達miR-196a對氯化高鐵血紅素誘導K562細胞凋亡的影響。（A,B）將miR-196amimics及miRNA-ShNC分別轉染氯化高鐵血紅素誘導后的K562細胞中，流式細胞儀檢測細胞凋亡率�？瞻捉M系無處理組。（C）以β-actin為內參，檢測miR-196amimics及miRNA-ShNC分別轉染氯化高鐵血紅素誘導K562細胞的Bax和Bcl-2蛋白水平。所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。每次處理一式三份，全部實驗重復三次。*p<0.05�？瞻讓φ�，系無miRNA轉染的陰性對照。miRNA-ShNC，microRNA小發(fā)夾陰性對照。


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