水稻既是重要的糧食作物也是單子葉植物生物學研究的模式材料,隨著水稻功能基因組學研究的深入及分子操作技術的成熟,有效解讀水稻內(nèi)源基因生物功能,進而進行有效的分子育種日益成為可能。細胞分裂素（cytokinin,CTK）是植物生長發(fā)育過程必不可少的激素成分,細胞分裂素氧化/脫氫酶（cytokinin oxidases/dehydrogenase,CKX）通過降解細胞分裂素,有效調(diào)控植物內(nèi)源細胞分裂素水平,是細胞分裂素信號通路中降解分支的關鍵酶。水稻全基因組中注釋了11個CKX基因,已有研究揭示了其中部分基因?qū)λ旧L的調(diào)控作用,但因為缺乏明確的突變體材料,水稻OsCKX基因家族具體成員的生物功能所至有限。本文應用CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a基因組編輯技術,以日本晴為模式材料,針對OsCKX基因家族成員進行定向敲除,創(chuàng)制OsCKX1^OsCKX11單基因及多基因定向敲除突變體材料,為系統(tǒng)研究OsCKX基因家族不同成員生物功能及有效進行分子育種奠定基礎。本文主要研究內(nèi)容及結果如下:1.基于CRISPR-Cas9核酸酶編輯系統(tǒng)向?qū)NA（single g... 

【文章來源】：電子科技大學四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

OsCKXs基因家族定向敲除靶位點設計示意圖

基于 CRISPR-Cas9 基因編輯的特點，本實驗針對 OsCKX1~OsCKX11 各個基因分別設計兩個目標基因靶位點，確保獲得足夠數(shù)目的理想突變體材料。CRISPR-Cas9 單基因定向敲除載體構建完成后通過根癌農(nóng)桿菌介導的水稻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化獲得再生植株，利用 PCR-SSCP、PCR-RFLP 技術對再生植株進行檢測并統(tǒng)計突變效率。從各個基因的中分別選擇兩個突變植株確定其基因型并種植收獲后代。3.2.1 CRISPR-Cas9 雙 sgRNA 定向敲除載體設計及構建3.2.1.1 載體設計本實驗基于骨架載體 pZHY988，針對 OsCKX1~OsCKX11 設計雙位點靶向單基因的敲除載體。通過 PCR 反應擴增獲得插入片段，包括酶切保護堿基和酶切位點、sgRNA1 及其 gRNAscaffold 部分、sgRNA2 及其 U6 啟動子。插入片段和骨架載體中均存在 BsaI 酶切位點，經(jīng) BsaI 酶酶切使骨架載體的 ccdB（致死基因）表達框缺失，取而代之為 T4 連接酶連入的 sgRNA 表達單元，完成載體構建。

第三章 結果與分析和下游引物，Cas9-Primer-F 和 Cas9-Primer-R 即（5’CATTGTGAATGTTTTGTTGGATC3’）和（5’TTCTAATAAACGCTCTTTTCTCT3’），正確構建載體則擴增片段大小為 951 bp，如圖 3-3（d）。挑選檢測正確的陽性單克隆擴大培養(yǎng)用于質(zhì)粒提取，質(zhì)粒送于生工生物技術有限公司測序驗證，成功構建 11 個定向敲除載體 pWY05~pWY15。


本文編號：3254904