旨為篩選并構(gòu)建II型內(nèi)含子編碼蛋白Mg²⁺結(jié)合位點(diǎn)突變體,驗(yàn)證該位點(diǎn)突變對(duì)II型內(nèi)含子"歸巢"效率的影響。利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選關(guān)鍵位點(diǎn),利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變體,利用Targetron及藍(lán)白斑計(jì)數(shù)法驗(yàn)證其"歸巢"效率。結(jié)果顯示,篩選到D308和D309兩個(gè)位點(diǎn)是II型內(nèi)含子編碼蛋白Mg²⁺結(jié)合的核心催化位點(diǎn),并成功構(gòu)建該位點(diǎn)的三種突變體,包括兩個(gè)單點(diǎn)突變體（D308A和D309A）和一個(gè)雙點(diǎn)突變體（D308A/D309A）,大腸桿菌體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三種突變體均完全失活了II型內(nèi)含子的"歸巢"功能。證實(shí)了II型內(nèi)含子編碼蛋白Mg²⁺結(jié)合位點(diǎn)是其發(fā)揮功能的核心催化位點(diǎn)。 

【文章來(lái)源】：生物技術(shù)通報(bào). 2020,36(10)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

II型內(nèi)含子“歸巢”示意圖

為了驗(yàn)證D308A、D309A、D308A/D309A突變對(duì)II型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響,將突變型IEP蛋白取代Targetron載體上的野生型IEP蛋白,構(gòu)建Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變的Targetron載體,同時(shí)以野生型Targetron載體作為對(duì)照,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)后涂布含有Xgal和IPTG的平板,過(guò)夜培養(yǎng)后通過(guò)菌落PCR(圖4)及藍(lán)白斑篩選(圖5-A),分析IEP蛋白Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)Ⅱ型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響。研究結(jié)果表明,野生型Ⅱ型內(nèi)含子在大腸桿菌中針對(duì)lacZ-635s位點(diǎn)的“歸巢”效率為90.845%±6.792%,針對(duì)lacZ-1063a位點(diǎn)的“歸巢”效率為92.582%±2.898%[24];然而,將IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域Mg2+結(jié)合位點(diǎn)(D308A、D309A、D308A/D309A)突變后,平板均為藍(lán)斑,菌落PCR驗(yàn)證其靶位點(diǎn)也沒(méi)有任何內(nèi)含子插入,其“歸巢”效率均降低為0%(圖4-5)。此結(jié)果表明,IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變,失活了IEP蛋白的反轉(zhuǎn)錄功能,使Ⅱ型內(nèi)含子不能以內(nèi)含子RNA為模板合成cDNA而插入到DNA靶位點(diǎn),即II型內(nèi)含子完全失去其“歸巢”功能。圖3 IEP蛋白生物信息學(xué)分析

IEP蛋白生物信息學(xué)分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]L1.LtrB內(nèi)含子編碼蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵催化位點(diǎn)分析及功能驗(yàn)證[J]. 陳相好,張崢嶸,劉芳,陳崢宏,洪偉,綦廷娜,谷俊瑩,崔古貞.  微生物學(xué)報(bào). 2019(12)
[2]高效嚴(yán)謹(jǐn)型大腸桿菌Targetron基因打靶系統(tǒng)的構(gòu)建[J]. 陳相好,劉芳,王彩霞,陳崢宏,洪偉,蔡夢(mèng)迪,張崢嶸,綦廷娜,廖永慧,谷俊瑩,崔古貞.  生物技術(shù)通報(bào). 2019(06)



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