高等植物的啟動(dòng)子是構(gòu)成基因表達(dá)載體的重要元件,影響外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)。啟動(dòng)子的序列中包含著許多順式作用元件,在轉(zhuǎn)錄水平上能夠調(diào)控相應(yīng)下游基因的表達(dá),從而增強(qiáng)植物對(duì)外界復(fù)雜生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力。對(duì)植物啟動(dòng)子的研究,有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制,還可直接應(yīng)用于植物基因工程中提高或改進(jìn)外源目的基因的表達(dá)。AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子在抗寒、抗旱、耐高溫、耐鹽等逆境脅迫中有重要作用,而且還可調(diào)節(jié)植物對(duì)激素如乙烯(ETH)和赤霉素(GA_3)等的應(yīng)答反應(yīng),在植物抗逆境脅迫中起重要作用。WRINKLED1(WRI1)轉(zhuǎn)錄因子,含有2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域,屬于AP2/EREBP家族一員。WRI1轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控脂肪酸代謝過程中也起到關(guān)鍵作用,控制著種子中從糖到油合成的碳源流。本課題組前期從大豆中克隆GmWRI1a基因,該基因通過調(diào)控大豆脂肪酸合成代謝途徑的相關(guān)基因BCCP2、FAE1、KAS1、ACP1等和糖酵解代謝途徑相關(guān)基因Pl-PKβ1、PDHE1α等提高大豆種子含油量,此外該基因還參與了大豆抗旱和耐鹽堿脅迫反應(yīng)。而通過對(duì)該基因啟動(dòng)子的研究,能夠進(jìn)一步鑒定該基因的功能。所以為了探究GmWRI1a基因的功能,本研究提取大豆東農(nóng)47基因組DNA,分離大豆GmWRI1a基因的啟動(dòng)子pGmWRI1a,定向替換CAMV35S(Cauliflower mosaic virus35S)組成型啟動(dòng)子,驅(qū)動(dòng)下游GUS基因的表達(dá)。并通過5’端缺失法構(gòu)建pGmWRI1a啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)載體轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,對(duì)GmWRI1a基因啟動(dòng)子分子結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了分析,初步闡明了pGmWRI1a啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)的分子基礎(chǔ),探究了pGmWRI1a啟動(dòng)子在植物生長(zhǎng)中的調(diào)控作用,為深入研究GmWRI1a基因的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.應(yīng)用PCR技術(shù)克隆了大豆GmWRI1a基因的啟動(dòng)子pGmWRI1a,通過在PLACE網(wǎng)站上對(duì)啟動(dòng)子全長(zhǎng)1669 bp的序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子不僅含有TATA-box、CAAT-box核心啟動(dòng)子區(qū)域,還存在多種順式作用元件,如含有與乙烯有關(guān)的基序(ERE),與赤霉素有關(guān)的基序(P-box、GARE-motif),與茉莉酸有關(guān)的基序(CGTCA-motif),ABA響應(yīng)元件CE3和光響應(yīng)元件G-box、GA-motif、ACE、AE-Box、ATC-motif、CATT-motif和GT1-motif等。2.構(gòu)建了GmWRI1a基因的啟動(dòng)子植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥,在正常培養(yǎng)條件下,通過GUS組織化學(xué)染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GmWRI1a啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥的根、莖、葉、花中表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗時(shí)期的下胚軸表達(dá)較弱。在花瓣、雄蕊和雌蕊柱頭都有表達(dá)。結(jié)果表明:GmWRI1a啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥整個(gè)生育期均能驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)。3.根據(jù)pGmWRI1a啟動(dòng)子主要順式元件的分布,采用啟動(dòng)子5’端缺失法,分別擴(kuò)增得到4個(gè)pGmWRI1a啟動(dòng)子5'端缺失片段1138 bp,1087 bp,690 bp和437 bp構(gòu)建植物表達(dá)載體,并利用花序法轉(zhuǎn)化擬南芥。通過啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)和各啟動(dòng)子缺失片段驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)結(jié)果,初步確定pGmWRI1a啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于-690～-437 bp之間。并分別利用2 mM赤霉素、0.1 mM茉莉酸及0.2 mM乙烯處理轉(zhuǎn)基因擬南芥,通過GUS酶活性檢測(cè),初步確定乙烯的響應(yīng)元件位于-1138～-1087 bp之間,茉莉酸的響應(yīng)元件位于-1087～-690 bp,赤霉素的響應(yīng)原件位于-690～-437 bp之間,干旱的響應(yīng)原件位于-1087～-690 bp之間。4.利用2 mM赤霉素、0.1 mM茉莉酸及0.2 mM乙烯處理大豆DN47植株,經(jīng)過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GmWRI1a基因受赤霉素和乙烯的正向調(diào)控,而茉莉酸對(duì)GmWRI1a基因沒有明顯的調(diào)控作用。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1;Q943.2
【部分圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文GUS 組織染色，確定 GmWRI1a 基因啟動(dòng)子在植株中的表達(dá)情況。同時(shí)，根據(jù)預(yù)測(cè)的 GmWRI1a啟動(dòng)子順式作用元件位置，利用啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)分析啟動(dòng)子的功能。通過探究 GmWRI1a 啟動(dòng)子的功能以及在植物生長(zhǎng)中的調(diào)控作用，為深入探究大豆 GmWRI1a 基因功能及調(diào)控機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。1.8 技術(shù)路線

以 SDS 小量法提取的大豆 DN47 基因組 DNA（圖 3-1）作為模板，以 GmWRI1a-1WRI1a-1669-R 為引物，PCR 擴(kuò)增 GmWRI1a 基因啟動(dòng)子序列。將 PCR 反應(yīng)液上電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，在約 1700 bp 處有清晰的條帶（圖 3-2），選取條帶正確膠回收，克隆到 pMDTM18T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取單菌落送至北京華大序。測(cè)序結(jié)果顯示，測(cè)序片段大小為 1669 bp，與 GmWRI1a 基因預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序，證明已經(jīng)克隆到了 GmWRI1a 基因啟動(dòng)子序列，命名為 pGmWRI1a。圖 3-1 DN47 大豆植株 DNA 提取Fig. 3-1 Extraction of DNA from DN47 cultivar

24注：序列中可能的順式作用元件用方塊和灰色陰影標(biāo)出；下畫線 ATG 為 GmWRI1a 基因的起始密碼子Note: Possible cis-acting elements in the sequence are indicated by squares and shades of gray; the lower line ATGis the start codon of the GmWRI1a gene.圖 3-3 GmWRI1a 基因啟動(dòng)子序列分析Fig. 3-3 Sequence analysis of GmWRI1a gene promoter

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本文編號(hào)：2830745