高等植物的啟動子是構成基因表達載體的重要元件,影響外源基因在植物體內的表達。啟動子的序列中包含著許多順式作用元件,在轉錄水平上能夠調控相應下游基因的表達,從而增強植物對外界復雜生長環(huán)境的適應能力。對植物啟動子的研究,有助于了解基因轉錄調控表達模式及其調控機制,還可直接應用于植物基因工程中提高或改進外源目的基因的表達。AP2/EREBP轉錄因子在抗寒、抗旱、耐高溫、耐鹽等逆境脅迫中有重要作用,而且還可調節(jié)植物對激素如乙烯(ETH)和赤霉素(GA_3)等的應答反應,在植物抗逆境脅迫中起重要作用。WRINKLED1(WRI1)轉錄因子,含有2個AP2結構域,屬于AP2/EREBP家族一員。WRI1轉錄因子在調控脂肪酸代謝過程中也起到關鍵作用,控制著種子中從糖到油合成的碳源流。本課題組前期從大豆中克隆GmWRI1a基因,該基因通過調控大豆脂肪酸合成代謝途徑的相關基因BCCP2、FAE1、KAS1、ACP1等和糖酵解代謝途徑相關基因Pl-PKβ1、PDHE1α等提高大豆種子含油量,此外該基因還參與了大豆抗旱和耐鹽堿脅迫反應。而通過對該基因啟動子的研究,能夠進一步鑒定該基因的功能。所以為了探究GmWRI1a基因的功能,本研究提取大豆東農47基因組DNA,分離大豆GmWRI1a基因的啟動子pGmWRI1a,定向替換CAMV35S(Cauliflower mosaic virus35S)組成型啟動子,驅動下游GUS基因的表達。并通過5’端缺失法構建pGmWRI1a啟動子缺失片段表達載體轉化模式植物擬南芥,對GmWRI1a基因啟動子分子結構及功能進行了分析,初步闡明了pGmWRI1a啟動子調控基因表達的分子基礎,探究了pGmWRI1a啟動子在植物生長中的調控作用,為深入研究GmWRI1a基因的功能奠定了良好的基礎。研究結果如下:1.應用PCR技術克隆了大豆GmWRI1a基因的啟動子pGmWRI1a,通過在PLACE網站上對啟動子全長1669 bp的序列進行分析,發(fā)現該啟動子不僅含有TATA-box、CAAT-box核心啟動子區(qū)域,還存在多種順式作用元件,如含有與乙烯有關的基序(ERE),與赤霉素有關的基序(P-box、GARE-motif),與茉莉酸有關的基序(CGTCA-motif),ABA響應元件CE3和光響應元件G-box、GA-motif、ACE、AE-Box、ATC-motif、CATT-motif和GT1-motif等。2.構建了GmWRI1a基因的啟動子植物表達載體并轉化擬南芥,在正常培養(yǎng)條件下,通過GUS組織化學染色試驗發(fā)現,GmWRI1a啟動子能夠驅動GUS基因在擬南芥的根、莖、葉、花中表達。在轉基因擬南芥幼苗時期的下胚軸表達較弱。在花瓣、雄蕊和雌蕊柱頭都有表達。結果表明:GmWRI1a啟動子在轉基因擬南芥整個生育期均能驅動GUS基因表達。3.根據pGmWRI1a啟動子主要順式元件的分布,采用啟動子5’端缺失法,分別擴增得到4個pGmWRI1a啟動子5'端缺失片段1138 bp,1087 bp,690 bp和437 bp構建植物表達載體,并利用花序法轉化擬南芥。通過啟動子轉錄起始位點的預測和各啟動子缺失片段驅動GUS報告基因的表達結果,初步確定pGmWRI1a啟動子轉錄起始位點位于-690～-437 bp之間。并分別利用2 mM赤霉素、0.1 mM茉莉酸及0.2 mM乙烯處理轉基因擬南芥,通過GUS酶活性檢測,初步確定乙烯的響應元件位于-1138～-1087 bp之間,茉莉酸的響應元件位于-1087～-690 bp,赤霉素的響應原件位于-690～-437 bp之間,干旱的響應原件位于-1087～-690 bp之間。4.利用2 mM赤霉素、0.1 mM茉莉酸及0.2 mM乙烯處理大豆DN47植株,經過qRT-PCR檢測發(fā)現GmWRI1a基因受赤霉素和乙烯的正向調控,而茉莉酸對GmWRI1a基因沒有明顯的調控作用。
【學位單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1;Q943.2
【部分圖文】：

東北農業(yè)大學農學碩士學位論文GUS 組織染色，確定 GmWRI1a 基因啟動子在植株中的表達情況。同時，根據預測的 GmWRI1a啟動子順式作用元件位置，利用啟動子缺失實驗分析啟動子的功能。通過探究 GmWRI1a 啟動子的功能以及在植物生長中的調控作用，為深入探究大豆 GmWRI1a 基因功能及調控機制奠定了良好的基礎。1.8 技術路線

以 SDS 小量法提取的大豆 DN47 基因組 DNA（圖 3-1）作為模板，以 GmWRI1a-1WRI1a-1669-R 為引物，PCR 擴增 GmWRI1a 基因啟動子序列。將 PCR 反應液上電泳檢測，結果表明，在約 1700 bp 處有清晰的條帶（圖 3-2），選取條帶正確膠回收，克隆到 pMDTM18T 載體，轉化大腸桿菌后挑取單菌落送至北京華大序。測序結果顯示，測序片段大小為 1669 bp，與 GmWRI1a 基因預測啟動子序，證明已經克隆到了 GmWRI1a 基因啟動子序列，命名為 pGmWRI1a。圖 3-1 DN47 大豆植株 DNA 提取Fig. 3-1 Extraction of DNA from DN47 cultivar

24注：序列中可能的順式作用元件用方塊和灰色陰影標出；下畫線 ATG 為 GmWRI1a 基因的起始密碼子Note: Possible cis-acting elements in the sequence are indicated by squares and shades of gray; the lower line ATGis the start codon of the GmWRI1a gene.圖 3-3 GmWRI1a 基因啟動子序列分析Fig. 3-3 Sequence analysis of GmWRI1a gene promoter

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本文編號：2830745