【背景】檸檬酸合成酶是碳代謝途徑的中心酶,其在三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA)、氨基酸合成和乙醛酸循環(huán)中發(fā)揮著重要作用,是檸檬酸合成的關(guān)鍵酶。本論文所選用的是一株高產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌株CGMCC10142�！灸康摹靠寺幟仕岷铣擅戈P(guān)鍵基因,構(gòu)建檸檬酸合成酶的敲除菌株并鑒定其在黑曲霉菌株高產(chǎn)檸檬酸過程中的功能及影響�！痉椒ā坎捎酶┺r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法并利用同源重組原理,采用抗性篩選和致死型反向篩選的雙重篩選方法獲得正確敲除株。對轉(zhuǎn)化子在不同碳源下的生長情況進(jìn)行觀察并對檸檬酸發(fā)酵過程中菌絲球變化和產(chǎn)酸量進(jìn)行分析,最后通過熒光定量PCR分析檸檬酸合成酶基因?qū)谇狗e累檸檬酸的影響,及其對主要代謝途徑中重要酶相關(guān)基因和其他的表達(dá)量的影響。【結(jié)果】以檸檬酸高產(chǎn)菌株黑曲霉CGMCC10142為出發(fā)菌,構(gòu)建一株遺傳穩(wěn)定的檸檬酸合成酶敲除的菌株T1-2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長緩慢并且產(chǎn)生孢子量減少。通過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明敲除菌在84 h產(chǎn)酸量為64.3 g/L,相對于出發(fā)菌的98.7g/L降低了34.85%。通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)檸檬酸合...

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【部分圖文】：

圖14個(gè)檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對

基于對CGMCC10142基因組的分析，該菌株具有4個(gè)編碼檸檬酸合成酶的基因。4個(gè)檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對如圖1所示，差異較大，但依然具有活性位點(diǎn)和乙酰輔酶A的結(jié)合位點(diǎn)。分別將黑曲霉4個(gè)檸檬酸合成酶的氨基酸序列與不同物種的檸檬酸合成酶比較發(fā)現(xiàn)，第4個(gè)檸檬酸合成酶(An09g0....

圖2檸檬酸合成酶cs基因的克隆

圖14個(gè)檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對2.2cs基因缺失菌株的構(gòu)建

圖3不同物種的檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對

由于自身基因的缺失和外源基因的隨機(jī)插入都會(huì)導(dǎo)致黑曲霉的生長形態(tài)發(fā)生改變(圖6)。從菌落形態(tài)可以看出，兩株菌以葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖為單一碳源時(shí)菌落較大，以阿拉伯糖、乳糖、乙酸鈉、丙酸鈉為唯一碳源時(shí)的菌落較小。從產(chǎn)孢情況來看，黑曲霉CGMCC10142在葡萄糖和半乳糖為唯....

圖4對不同物種檸檬酸合成酶構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3不同物種的檸檬酸合成酶的氨基酸序列比對圖5敲除株質(zhì)粒構(gòu)建過程和陽性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

本文編號(hào)：4005799