發(fā)布時間：2020-09-29 20:56

　　 植物通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度對外界不良環(huán)境因素進行防御。鈣調(diào)素(CaM)是一類最主要的鈣離子感受器,鈣離子-鈣調(diào)素(Ca2+-CaM)復合體與鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(CBPs)結(jié)合構(gòu)象發(fā)生變化后參與植物對生物和非生物脅迫的響應。CBP60g蛋白作為CBPs蛋白家族中的重要一員,在抗病、抗旱、正向調(diào)節(jié)ABA和SA介導的信號途徑以及負調(diào)控花青素的合成過程中起著非常重要的作用。本研究嘗試了在大腸桿菌和昆蟲細胞內(nèi)進行可溶性表達和純化擬南芥CBP60g蛋白,期望為今后解析其三維結(jié)構(gòu)提供依據(jù)。具體結(jié)果如下:1.對CBP60g的氨基酸序列進行分析和預測表明,其含有11個糖基化位點、76個磷酸化位點、沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。2.以野生擬南芥cDNA為模板,利用PCR擴增技術(shù)得到擬南芥CBP60g故基因,其cDNA 全長為 1689 bp。3.利用TEV-LIC技術(shù)分別構(gòu)建大腸桿菌表達載體,并轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)。經(jīng)不同濃度IPTG進行誘導,SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn),目的蛋白CBP60g主要以包涵體的形式存在。4.成功構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體,轉(zhuǎn)化到E.coli DH1OBac后得到重組桿狀病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染到昆蟲細胞中進行表達蛋白。SDS-PAGE檢測目的蛋白大小約為75 KDa,比預測蛋白大小(62 KDa)略大。經(jīng)過陰離子交換純化后,根據(jù)所建立的蛋白標準曲線計算蛋白濃度為996.5 ng/mL,經(jīng)過Western Blotting驗證,所純化的蛋白質(zhì)為CBP60g。
【學位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

鈣感成蛋白通過鈣離子應答啟動子元件接收到鈣信號后，在通過激活鈣離子調(diào)節(jié)的逡逑靶酶與Ｃａ２＋受體蛋白相互作用，進行解碼和轉(zhuǎn)導，通過受體蛋白將鈣離子濃度變化逡逑所蘊含的外界信息表達為生理生化過程＂８］。如圖１所示，當鈣調(diào)素ＣａＭ７過表達后，逡逑通過與ＤＮＡ結(jié)合的方式，從而使光誘導基因的表達量增加和高光形態(tài)發(fā)生。ＣＡＭ逡逑ＴＡ３是真核生物中依賴性鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，Ｃａ２＋／ＣａＭ的復合體與ＣＡＭＴＡ結(jié)逡逑合后，通過調(diào)控冷調(diào)節(jié)基因的ＣＢＦ啟動子從而促進植物冷凍耐受性。ＣＰＫ３和ＣＰＫ６逡逑在ＡＢＡ中的作用為調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細胞Ｓ型陰離子通道。ＣＤＰＫｓ通過ＮＡＤＰＨ逡逑的調(diào)節(jié)產(chǎn)生ＲＯＳ氧化酶。ＣＢＬ鈣傳感受器Ｓ０Ｓ３邋（ＡｔＣＢＬ４）和ＣＩＰＫ型激酶Ｓ０Ｓ３逡逑（ＡｔＣＩＰＫ２４）通過調(diào)節(jié)Ｎａ＋／Ｈ＋反轉(zhuǎn)運子Ｓ０Ｓ１進而特異性調(diào)節(jié)鹽脅迫適應的調(diào)節(jié)信逡逑兮通路。逡逑

ｎｍ長的分子［２３］。Ｎ－末端和Ｃ－末端的環(huán)區(qū)域和兩端的ａ螺旋區(qū)形成典型的螺旋－環(huán)－逡逑螺旋ＥＦ手型結(jié)構(gòu)域。中央非螺旋區(qū)由７８？８１氨基酸殘基構(gòu)成［２４］，具有很強的延展逡逑性，使其可以與不同空間結(jié)構(gòu)的靶蛋白相結(jié)合，如圖２所示。逡逑鈣調(diào)素本身沒有催化活性。當疏水性區(qū)域暴露，ＥＦ手型結(jié)構(gòu)域結(jié)合Ｃａ２＋，并通逡逑過鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與鈣調(diào)素結(jié)合蛋白相互作用［２５］。目前，從擬南芥、玉米、煙草、逡逑水稻、小麥等多種植物中分離出的鈣調(diào)素氨基酸序列是高度保守的［２６２７］。植物中存逡逑在多種鈣調(diào)素基因，編碼相同蛋白質(zhì)或者類似蛋白質(zhì)，稱為鈣調(diào)素亞型。鈣調(diào)素亞逡逑型與哺乳動物氨基酸序列同源性約為９０％，鈣調(diào)素亞型的存在使鈣信號的轉(zhuǎn)導信號逡逑途徑變得更加豐富有趣。鈣調(diào)素對細胞分裂的調(diào)控與生長素的調(diào)節(jié)起到作用，對植逡逑物的衰老死亡起到很重要作用。有研究表明植物細胞外還含有鈣調(diào)素和鈣調(diào)素結(jié)合逡逑

ｐＦａｓｔＢａｃ？表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ＤＨｌＯＢａｃ細胞中，ｐＦａｓｔＢａｃ？菌株上的單位ｍｉｎｉ－Ｔｎ７與耙位逡逑點ｍｉｎｉ－ａｔｔＴｎ７發(fā)生重組。將構(gòu)建成功的重組桿狀病毒質(zhì)粒，感染處于生長對數(shù)期的逡逑細胞以產(chǎn)生含有目的基因的重組病毒，如圖４所示。Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ邋Ｆｉｖｅ為常用的逡逑細胞宿主。桿狀病毒具有許多真核蛋白的加工修飾方式，如折疊、寡聚化、磷酸化、逡逑糖基化、酞化、二硫鍵形成、溶蛋白性裂解等。逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2830248