蕨類植物作為最早的維管植物,介于低等植物和高等植物之間,而且形態(tài)結(jié)構(gòu)多樣,常被用來作為研究植物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育的重要對象。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的主組成成分,在植物的生長發(fā)育中起到了重要的作用。木質(zhì)素是由木質(zhì)素單體聚合而成,木質(zhì)素單體的生物合成過程中氧甲基化是一步非常重要的反應(yīng)。植物體內(nèi)參與木質(zhì)素單體生物合成的氧甲基轉(zhuǎn)移酶有兩種:咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeic acid O-methyltransferases,COMTs)和咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeoyl CoA O-methyltransferases,CCoAOMTs),都屬于S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)作為甲基供體的氧甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferases,OMTs)。CCoAOMTs主要在高等植物里被鑒定。目前,在江南卷柏中克隆鑒定了 1個COMT基因,參與木質(zhì)素生物合成的CCoAOMTs基因的研究在蕨類植物中還未發(fā)現(xiàn)。為了研究蕨類植物中Ⅰ型OMTs的進(jìn)化以及功能,本論文從厚囊蕨,原始薄囊蕨和薄囊蕨中共選取了 51種蕨類植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從中搜索注釋為CCoAOMT的基因。結(jié)果顯示,在厚囊蕨中沒有CCoAOMTs基因的存在,有4個基因?qū)儆谠急∧肄?37個基因?qū)儆诒∧肄�。將這些基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,結(jié)果表明,友水龍骨(Polypodiodes amoena)和鐵線蕨(Adinatum Capillus-veneris)中各有一個CCoAOMT基因位于原始薄囊蕨基因進(jìn)化支的根部,各有一個CCoAOMT基因位于薄囊蕨基因進(jìn)化支的中間部位,于是將這4個基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究。首先將這4個基因分別命名為 PaCCoAOMT1、PaCCoAOMT2、AcCCoAOMT1和AcCCoAOMT2,并將其序列輸入到NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST顯示,它們都屬于Ⅰ型氧甲基轉(zhuǎn)移酶家族。利用PCR技術(shù)分別從各自植物的cDNA中克隆得到完整的ORF,并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列,與苜蓿MsCCoAOMT進(jìn)行序列比對和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),這4個OMT基因進(jìn)化上位于高等植物真正的CCoAOMT進(jìn)化支的根部,與MsCCoAOMT的序列相似性都在60%以上。利用基因重組技術(shù)將4個CCoAOMT基因分別構(gòu)建到原核蛋白表達(dá)載體上,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶的重組蛋白并進(jìn)行體外酶活實驗,以苜蓿的MsCCoAOMT蛋白活性作為對照。酶活結(jié)果顯示,4個CCoAOMT基因?qū)S酮類化合物均具有較高的催化效率,可以特異性的甲基化黃酮B環(huán)上的3'位羥基,以及A環(huán)上6位羥基,對于B環(huán)上含有單個羥基的芹菜素、柚皮素和山奈酚均不具催化特性,具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)間位氧甲基化的催化特點(diǎn)。對于苯丙素類化合物,4個CCoAOMT均對咖啡酰-CoA催化活性最高,且轉(zhuǎn)化率與MsCCoAOMT相當(dāng)。通過煙草下表皮瞬時表達(dá)實驗對PaCCoAOMTs-GFP融合基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究,結(jié)果表明PaCCoAOMTs基因都定位在細(xì)胞質(zhì)中。為了進(jìn)一步研究蕨類植物中CCoAOMTs基因在植物體內(nèi)的功能,分別將PaCCoAOMT1和PaCCoAOMT2構(gòu)建入植物表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入了模式植物擬南芥中,對轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素和黃酮醇的含量進(jìn)行測定,并與野生型植株進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中的木質(zhì)素含量明顯增高,而氧甲基化黃酮醇的含量沒有明顯的差異。說明PaCCoAOMTs基因在植物體內(nèi)參與木質(zhì)素的生物合成,不參與黃酮醇氧甲基化反應(yīng)。本課題鑒定了 4個參與木質(zhì)素單體和黃酮氧甲基化的CCoAOMT基因,有助于理解CCoAOMT基因的進(jìn)化以及木質(zhì)素的起源與演化。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q946.5
【部分圖文】：

松樹［７２，７３］，楊樹［７４＿７６］，紅花［７７］和亞麻［７８］等。在苜蓿（Ｍｅ沿⑶ｇｏ血／似）的逡逑研宄中，已經(jīng)獲得了苜蓿中ＣＣｏＡＯＭＴ基因的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，鑒定出了影響與逡逑底物結(jié)合以及與ＳＡＭ和Ｍｇ２＋結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)（圖１－１）。逡逑圖１－１邋ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ－ＣＣＯＡ復(fù)合晶體三維結(jié)構(gòu)逡逑據(jù)報道，在對擬南芥的研宄中，對擬南芥中的ＣＣｏＡＯＭＴ進(jìn)行突變，通過逡逑分析木質(zhì)素的含量表明，突變體植株中的木質(zhì)素含量比野生型明顯減少，且Ｇ木逡逑質(zhì)素的含量也相對下降［７９］，這進(jìn)一步證明了邋ＣＣｏＡＯＭＴ參與了木質(zhì)素合成，尤逡逑其是對Ｇ木質(zhì)素的生物合成具有重要作用。對擬南芥、水稻和楊樹全基因組的逡逑分析表明，擬南芥、水稻和楊樹中分別有１０個、９個和６個ＣＣｏＡＯＭＴ序列，逡逑１１逡逑

的研究表明，木質(zhì)素單體合成需要一系列細(xì)胞色素Ｐ４５０依賴性單加氧酶（Ｐ４５０ｓ）逡逑和Ｓ－腺苷－Ｌ－甲硫氨酸（ＳＡＭ）依賴性０－甲基轉(zhuǎn)移酶（ＯＭＴｓｆｌ邋Ｇ－木質(zhì)素的單逡逑體是松柏醇（圖１－２），ＣＣｏＡＯＭＴ可以甲基化咖啡酰輔酶Ａ邋３－ＯＨ生成阿魏酰輔逡逑酶Ａ，進(jìn)一步還原生成松柏醇，所以它們在裸子植物和被子植物的Ｇ－木質(zhì)素單逡逑體的甲基化中起重要作用。Ｓ－木質(zhì)素單體是芥子醇，可以由肉桂醇脫氫酶逡逑（ｃｉｎｎａｍｙｌ邋ａｌｃｏｈｏｌ邋ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，邋ＣＡＤ）催化芥子醛而來，ＣＯＭＴ邋可以甲基化邋５－逡逑ＯＨ松柏醛的５位羥基，生成Ｓ－木質(zhì)素單體的前體物質(zhì)芥子醛，所以ＣＯＭＴ主逡逑要參與合成裸子植物以及被子植物中的Ｓ－木質(zhì)素的生成。ＣＣｏＡＯＭＴ和ＣＯＭＴ逡逑在植物體內(nèi)的表達(dá)，對木質(zhì)素這種聚合物的結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要［９９］。逡逑１３逡逑

PaCCoAOMTs和AcCcoAOMTs的蛋亡

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本文編號：2830426