水楊酸(Salicylic acid,SA)是一種調(diào)控植物生長發(fā)育的重要植物酚類激素,精確地調(diào)控植物體內(nèi)SA的合成代謝和分解代謝對于維持SA的動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義。我們前期實(shí)驗(yàn)證明SA羥基化是SA的重要修飾方式,通過清除植物體內(nèi)過多的SA來調(diào)控SA動(dòng)態(tài)平衡,其中S5H受SA誘導(dǎo),將SA羥基化生成2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHBA),但是對于SA羥基化酶基因S5H的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理尚不清楚。本研究以SA羥基化酶基因S5H為突破口,利用酵母單雜交技術(shù),篩選與S5H啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子,利用遺傳學(xué)、植物生理學(xué)、植物代謝、形態(tài)學(xué)等方法研究其表達(dá)調(diào)控模式和生物學(xué)功能,從而解析S5H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),主要研究結(jié)果如下:(1)鑒定了598 bp的S5H啟動(dòng)子區(qū)域具有完整的啟動(dòng)子功能由于全長S5H啟動(dòng)子作為“誘餌”進(jìn)行AbA抗性篩選時(shí),其在酵母單雜交系統(tǒng)中存在自激活現(xiàn)象,因此我們將啟動(dòng)子截短為598 bp、1232 bp、1843 bp三個(gè)不同長度片段,以GUS作為報(bào)告基因構(gòu)建雙元表達(dá)載體,用于篩選具有功能的較短的啟動(dòng)子片段。煙草瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系的GUS染色結(jié)果表明,這三段啟動(dòng)子片段均具有啟動(dòng)子活性且具有SA誘導(dǎo)活性,因此我們利用598 bp S5H啟動(dòng)子作為誘餌用于酵母單雜交篩選調(diào)控S5H基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。(2)通過酵母單雜交篩選驗(yàn)證獲得了6個(gè)與S5H啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子選用衰老葉片和病原菌Pst DC3000處理的葉片提取RNA,建立cDNA文庫,利用酵母單雜交系統(tǒng)篩選調(diào)控S5H表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。通過對陽性克隆PCR產(chǎn)物檢測,經(jīng)測序和NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對分析,獲得15個(gè)轉(zhuǎn)錄因子作為候選互作蛋白。結(jié)合酵母單雜交系統(tǒng)與DLR分析系統(tǒng)驗(yàn)證結(jié)果確認(rèn)轉(zhuǎn)錄因子WRKY1、AXR2、PH、C2H2、HMG和WRKY18與598 bp的S5H啟動(dòng)子存在潛在的結(jié)合關(guān)系。(3)基因缺失和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明WRKY1調(diào)控葉片衰老表型通過分子鑒定獲得了互作蛋白的T-DNA插入純合突變體,對其進(jìn)行葉片離體黑暗誘導(dǎo)處理。發(fā)現(xiàn)與野生型相比,wrky18,axr2突變體葉片具有提前衰老的表型,wrky1,nac6突變體葉片出現(xiàn)晚衰表型。結(jié)合酵母單雜交系統(tǒng)與DLR分析系統(tǒng)結(jié)果,我們選取了WRKY1作為目標(biāo)基因進(jìn)行深入研究,通過構(gòu)建WRKY1過表達(dá)株系,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系出現(xiàn)葉片早衰表型,進(jìn)一步說明WRKY1基因與葉片衰老密切相關(guān)。(4)WRKY1超表達(dá)和wrky1突變體中水楊酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)特征在WRKY1-OE中,S5H,S3H基因的表達(dá)顯著上升,同時(shí)水楊酸合成基因ICS1,ICS2的表達(dá)明顯上調(diào),另外,SAG13,PR1,SGR1在過表達(dá)植物中基因顯著上調(diào),與其葉片早衰表型一致,而在wrky1中被抑制表達(dá),與其葉片衰老延緩表型相一致。(5)WRKY1超表達(dá)和wrky1突變體中水楊酸的代謝分析通過對WRKY1超表達(dá)和突變體植株中自由態(tài)SA,總SA以及總2,5-DHBA的測定結(jié)果顯示,與野生型相比,超表達(dá)株系中三種成分均有所上升,而突變體wrky1中的總SA以及2,5-DHBA含量顯著下調(diào)。因此我們推測可能由于WRKY1協(xié)調(diào)誘導(dǎo)ICS1,ICS2以及S5H的表達(dá)從而增加了SA和2,5-DHBA的合成,誘導(dǎo)了葉片早衰進(jìn)程。綜上所述,本研究證明598 bp的S5H啟動(dòng)子區(qū)域具有完整的啟動(dòng)子功能,并利用其作為誘餌片段篩選S5H基因的調(diào)節(jié)因子。驗(yàn)證獲得了6個(gè)與S5H啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步鑒定獲得了一個(gè)能夠調(diào)控SA和2,5-DHBA代謝以及葉片衰老的轉(zhuǎn)錄因子WRKY1。
【學(xué)位單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

1圖 1.1 擬南芥植株及葉片衰老示意圖[8]re 1.1Amodel of the leaf senescence and whole-plant senescence inArabi

圖 1.2 擬南芥 SA 修飾和分解代謝途徑的簡化示意圖[78]re 1.2 Schematic for SAmodification and catabolism pathway inArabidop酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

圖 3.1 Y1HGold [S5H-pAbAi]AbAr背景表達(dá)水平檢測1HGold [S5H-pAbAi]與陽性對照 Y1HGold [p53-AbAi]在含有不同濃度的 AbA 抗性缺養(yǎng)基上生長情況。AbA 濃度為 100 ng/mL 時(shí)，Y1HGold [p53-AbAi]酵母菌落生長受到抑 AbA 濃度為 500 ng/mL，Y1HGold [S5H-pAbAi]酵母菌斑大小幾乎沒有改變，說明仍

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本文編號：2830181