細胞培養(yǎng)是體外研究細胞功能的重要技術(shù)手段。長期以來,基于培養(yǎng)皿的二維平面培養(yǎng)(2-dimensional culture,2D culture)在細胞生物學研究中得到了最為廣泛的應用。然而,細胞在2D培養(yǎng)模式中的單層生長(monolayer)與細胞在體內(nèi)環(huán)境中的生長方式的極大差異引起了研究者對體外細胞培養(yǎng)模式的思考。特別是在腫瘤藥物的開發(fā)過程中,很多在體外細胞實驗中展示良好抗腫瘤效果的藥物,在體內(nèi)實驗中抗瘤效果卻并不理想。三維細胞培養(yǎng)(3-dimensional culture,3D culture)是指在體外培養(yǎng)中通過使用特殊培養(yǎng)皿或支架材料,形成營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物和氧氣的梯度,從而重現(xiàn)細胞體內(nèi)環(huán)境,彌補單層培養(yǎng)缺陷的一種細胞培養(yǎng)模式。紙是人類最古老最重要的發(fā)明之一,而將紙基類材料作為一種新型的基底用于細胞培養(yǎng)則是古代智慧與現(xiàn)代科技的完美結(jié)合。首先,紙基中大量類似組織間隙的微小孔隙利于營養(yǎng)物質(zhì)擴散,為細胞提供養(yǎng)分。其次,與基于聚二甲基硅氧烷(poly-dimethylsiloxane,PDMS)的細胞培養(yǎng)芯片相比,紙基的獨特之處在于通過多層疊加可方便地實現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)組織/器官構(gòu)建,而通過拆解多層紙基實現(xiàn)從3D至2D的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,從而實現(xiàn)組織內(nèi)部細胞形態(tài)和功能的觀測分析。由于將紙類材料作為細胞培養(yǎng)的嘗試剛剛開始,目前用于細胞培養(yǎng)的紙基材料主要是Whatman@#114號濾紙和Whatman@#105號擦鏡紙,類型較為單一且同類比較下價格比較昂貴;有必要尋找適用于細胞培養(yǎng)的價廉物美的類紙基材料。此外,在實驗中多需要將細胞先混合于水凝膠溶膠中再滴加到濾紙上。而且,在CiGiPs細胞培養(yǎng)模型中,紙質(zhì)基底僅作為一種支架材料為水凝膠提供網(wǎng)絡支撐,雖然解決了水凝膠塑形的問題,但仍缺乏相關的生物功能;同時,水凝膠現(xiàn)用現(xiàn)配的特性,降低了芯片制作使用的便捷性和普適性�；趯ι鲜鱿嚓P領域和關鍵技術(shù)現(xiàn)狀與問題的分析,本論文首次探索了將中國傳統(tǒng)書畫用紙-宣紙用來探究細胞三維培養(yǎng)的潛力;將明膠溶液與聚丙烯無紡布采用冷凍干燥的方式制備即用型明膠@聚丙烯無紡布復合材料,用于細胞三維培養(yǎng);進一步在即用型明膠@聚丙烯無紡布復合材料上有效負載細胞因子,構(gòu)建具有生物活性的紙基,為細胞提供仿生三維生長環(huán)境和構(gòu)建仿生微環(huán)境,為探究功能化類紙基為基材的仿生芯片奠定基礎。本文主要研究內(nèi)容如下:1、探索宣紙作為經(jīng)濟適用型細胞三維培養(yǎng)基材的潛力宣紙是我國所特有的書畫用紙,具有柔韌、潔白、紋理清晰、潤墨性好等特點,有“紙壽千年”的美譽。宣紙種類選擇多,厚度可調(diào)控、價格相對低廉。本工作首先從市售種類的宣紙中選擇了生宣、熟宣、半生半熟這三種宣紙作為研究對象。通過液體實驗對宣紙的液體浸潤性進行評估,結(jié)果顯示生宣具備更加優(yōu)異的液體浸潤性,為細胞培養(yǎng)過程中細胞培養(yǎng)液的補給提供了條件。進一步將生宣與紙基材料(Whatman@#114號濾紙和Whatman@#105號擦鏡紙)進行比較,研究發(fā)現(xiàn)宣紙的纖維素成分更加純粹、纖維與纖維之間的小腔室有利于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和細胞之間的遷移。不同厚度的宣紙用于細胞培養(yǎng)。通過乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)釋放實驗發(fā)現(xiàn)宣紙對細胞的生長無毒性影響;通過WST-1細胞增殖測試發(fā)現(xiàn)細胞可以在宣紙上正常生長,而且在80μm厚的宣紙中細胞增殖最高,展示了良好的細胞相容性。宣紙纖維為細胞黏附與生長提供3D網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。通過細胞染色可以觀察到,細胞在宣紙網(wǎng)絡上大量黏附,而且隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞呈現(xiàn)增殖生長的趨勢且依附宣紙纖維走向生長。最后通過構(gòu)建基于宣紙的細胞免疫分析平臺測定了前列腺癌中O-GaINAc的表達。與傳統(tǒng)細胞微孔板相比,宣紙的纖維結(jié)構(gòu)所提供的更大的比表面積促進了細胞的黏附和增殖,增強了細胞免疫分析中信號的表達,提高了細胞免疫檢測的靈敏度,展示了宣紙應用到細胞分析平臺的潛力。2、即用型明膠@聚丙烯無紡布復合材料的構(gòu)建及其在3D細胞培養(yǎng)中的應用明膠(gelatin)是一種從動物體內(nèi)提取出的膠原蛋白,具有良好的生物相容性,并被用于包被細胞培養(yǎng)皿以促進細胞黏附。聚丙烯(polypropylene)是應用最為廣泛的聚合物之一,具有機械強度強、易于加工等特點。本工作中,我們首次提出了即用型CiGiPs的概念。我們將明膠溶液滴加到以聚丙烯為原材料的無紡布(polypropylene nonwoven fabric)基底上,采用冷凍干燥的方式制備即用型明膠@聚丙烯無紡布復合材料。在即用型明膠@聚丙烯無紡布復合材料中,明膠溶液的引入在聚丙烯無紡布的纖維與纖維之間形成蜂窩狀的小腔室,增加了復合材料的比表面積。材料的孔隙率、溶脹性質(zhì)和剛性測定實驗表明,明膠@聚丙烯無紡布復合材料孔隙率顯著增加,良好的溶脹性質(zhì)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的儲存。明膠@聚丙烯無紡布復合材料的生物相容性實驗證明,明膠@聚丙烯無紡布復合材料可以應用于細胞培養(yǎng),細胞大量黏附并呈現(xiàn)增殖生長的趨勢。為了突出所提出的復合材料即用型這一概念,我們對最長放置了90天的復合材料進行了性質(zhì)測試,結(jié)果顯示明膠@聚丙烯無紡布復合材料化學性質(zhì)和溶脹性質(zhì)都未發(fā)生改變,更為重要的是細胞相容性保持良好,展現(xiàn)了作為細胞3D培養(yǎng)基材的應用潛力。3、細胞因子修飾的明膠@聚丙烯無紡布復合材料細胞因子是由免疫細胞和基質(zhì)細胞合成的低分子量蛋白質(zhì),其通過與特定的受體結(jié)合來調(diào)控、參與人體的各種生理活動。在本工作中,將血管內(nèi)皮生長因子(Human vascular endothelial growth factor,hrVEGF)負載于明膠@聚丙烯無紡布復合材料,構(gòu)建具有生物活性的類紙基材料,為血管內(nèi)皮細胞提供仿生三維生長環(huán)境。首先,探究如何在明膠@聚丙烯無紡布復合材料上有效負載細胞因子。通過吸附法、EDC/NHS共價結(jié)合方法和混合物冷凍干燥法制備負載生長因子的明膠@無紡布復合材料。研究結(jié)果顯示具有生物活性的明膠@無紡布材料有利于細胞的快速黏附,并促進血管內(nèi)皮細胞增殖。此外,將負載細胞因子的明膠@聚丙烯復合材料多層疊加構(gòu)建細胞遷移模型。結(jié)果顯示細胞可以從種植層遷移到負載細胞因子的遷移層,為構(gòu)建功能化類紙基為基材的仿生芯片奠定基礎。
【學位單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q813.11
【部分圖文】：

西南大學碩士學位論文胞分析平臺的應用胞培養(yǎng)被應用于細胞生物學的不同分支[53,54]。在疾被用于構(gòu)建疾病模型[55,56]。癌癥發(fā)展的快慢與腫瘤不同類型的細胞和多種細胞基質(zhì)組成。傳統(tǒng)的 2D復雜情況，因此 Camci-Unal[51]等開發(fā)了一種 3D 多效的探究了腫瘤基質(zhì)對癌細胞遷移的影響；通過熱 Matrigel 包封細胞，將原代人肺癌細胞和原發(fā)性人上共培養(yǎng)(圖 2.1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人肺腫瘤細胞可以遷移法簡單有效的探究了腫瘤基質(zhì)對癌細胞遷移的影響理解癌癥進展與不同細胞基質(zhì)之間的關系提供了可

型紙基材料培養(yǎng)誘導人多功能干細胞(h-iPSC)[58](a)不同類型紙基h-iPSC 細胞在不同類型紙基材料上的生長。椎動物最基本的器官之一，可以為身體提供機械支撐，有助物質(zhì)、保護內(nèi)臟、形成白細胞和紅細胞等[60-62]。為了解決各造成的骨質(zhì)流失，研究者們提出了許多策略用于制備再生支助專業(yè)的設備、昂貴的材料和可長期執(zhí)行的方案，而且這類細胞的均勻分布和遷移。因此開發(fā)具備生理學尺寸大小、生內(nèi)骨骼礦化過程相對重要。Camci-Unal[63]等人通過將紙折程支架。在這項工作中，紙的柔韌性提供了采用折痕、折疊D 結(jié)構(gòu)紙支架(圖 2.3A)的優(yōu)勢；將小鼠成骨細胞接種于支架長，肉眼可見支架逐漸礦化(圖 2.3B)。通過使用免疫染色、層掃描的方法來評估礦物質(zhì)的沉積程度，發(fā)現(xiàn)紙支架模擬骨基材料性質(zhì)(厚度、孔隙率、化學組成、纖維密度)的可調(diào)控建具備得天獨厚的優(yōu)勢。另外，紙基材料支持在整個 3D 結(jié)

脊椎動物最基本的器官之一，可以為身體提供機械支撐，有助于礦物質(zhì)、保護內(nèi)臟、形成白細胞和紅細胞等[60-62]。為了解決各種原等造成的骨質(zhì)流失，研究者們提出了許多策略用于制備再生支架借助專業(yè)的設備、昂貴的材料和可長期執(zhí)行的方案，而且這類材制細胞的均勻分布和遷移。因此開發(fā)具備生理學尺寸大小、生物體內(nèi)骨骼礦化過程相對重要。Camci-Unal[63]等人通過將紙折疊成工程支架。在這項工作中，紙的柔韌性提供了采用折痕、折疊、 3D 結(jié)構(gòu)紙支架(圖 2.3A)的優(yōu)勢；將小鼠成骨細胞接種于支架上延長，肉眼可見支架逐漸礦化(圖 2.3B)。通過使用免疫染色、高斷層掃描的方法來評估礦物質(zhì)的沉積程度，發(fā)現(xiàn)紙支架模擬骨組紙基材料性質(zhì)(厚度、孔隙率、化學組成、纖維密度)的可調(diào)控性構(gòu)建具備得天獨厚的優(yōu)勢。另外，紙基材料支持在整個 3D 結(jié)構(gòu)；細胞能夠在支架上黏附、生長、增殖和重塑。受紙支架模擬骨將紙支架引入到骨修復和骨再生研究中為患者定制個性化治療方

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本文編號：2828812