葫蘆科作物是我國重要的經(jīng)濟作物。在中國28種以上病毒侵染為害葫蘆科作物,每年可造成高達300億元人民幣的損失。隨著全球氣候變暖,國際貿(mào)易交流頻繁,種植地域的擴張以及種植模式的多樣化,侵染葫蘆科作物的病毒病種類發(fā)生報道也逐年增加。本研究調(diào)查全國西瓜和甜瓜的主要產(chǎn)區(qū)的病毒病的發(fā)生情況并采集疑似病毒樣本應(yīng)用二代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)結(jié)合常規(guī)檢測方法鑒定和檢測病毒種類;鑒定了2種葫蘆科作物上新發(fā)生的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒;鑒定了1種侵染西葫蘆的馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)新病毒;對4種常見的病毒進行系統(tǒng)進化和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析,本文取得如下主要結(jié)果:(1)明確了中國葫蘆科作物病毒種類與分布。調(diào)查了華南沿海冬季產(chǎn)區(qū),長江以南丘陵產(chǎn)區(qū),華中平原優(yōu)勢產(chǎn)區(qū),西南坡地和山區(qū)種植區(qū)以及西北旱地優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)為代表的9個省份,31個區(qū)縣,52塊種植地塊的以西瓜和甜瓜為主的葫蘆科作物上病毒病發(fā)生情況。共采集了288份疑似病毒樣本,其中西瓜109份,甜瓜95份,南瓜57份,其他葫蘆作物共27份。初步比較了小RNA測序(Small RNA sequencing,sRNA-seq)和去核糖體RNA測序(Ribo-minus RNA sequencing,rmRNA-seq)技術(shù)應(yīng)用于鑒定和檢測病毒的差異。應(yīng)用NGS測序技術(shù)和常規(guī)檢測技術(shù)檢測到12個屬22種病毒,其中已知病毒種21個,新病毒種1種。以病毒核酸類型分類比較,正單鏈RNA病毒(Positive-sense single-stranded RNA virus,+ssRNA virus)占優(yōu);以病毒屬分類比較:馬鈴薯Y病毒屬占優(yōu);以病毒種分類比較:小西葫蘆黃花葉病毒(zucchini yellow mosaic virus)占優(yōu);以田間傳播類型分類比較:以蚜蟲傳播方式占優(yōu);以侵染單個樣本的病毒數(shù)量分類;單個病毒侵染樣本數(shù)量占優(yōu)。比較分析了不同葫蘆科作物中檢出病毒的種類與分布差異。比較分析了不同種植地區(qū)病毒發(fā)生與分布情況,其中明顯差異是華南地區(qū)以薊馬傳播病毒種類占優(yōu),而其他地區(qū)均是以蚜蟲傳播方式占優(yōu)。(2)明確了小西葫蘆虎紋花葉病毒和番木瓜畸形花葉病毒的生物學(xué)特性和基因組信息。在NGS和RT-PCR鑒定的基礎(chǔ)上,測定了小西葫蘆虎紋花葉病毒(zucchini tigre mosaic virus)和番木瓜畸形花葉病毒(papaya leaf distortion mosaic virus)的全基因組序列,分析了其基因組特性。ZTMV是一種重組病毒;PLDMV與目前報道的番木瓜株系基因組水平差異較大。通過重組融合方法成功構(gòu)建了ZTMV和PLDMV侵染性克隆,從多種病毒復(fù)合侵染樣本中獲得2種病毒3個分離物純化病毒材料并驗證了其侵染性和傳毒能力。測定了2種病毒4個分離物的寄主范圍以及在不同葫蘆科作物上的癥狀表現(xiàn)。(3)發(fā)現(xiàn)和鑒定一株馬鈴薯卷葉病毒屬新病毒。我們鑒定了新疆維吾爾族自治區(qū)阜康市西葫蘆上的一株馬鈴薯卷葉病毒屬新病毒命名為小西葫蘆蚜傳黃化病毒(zucchini aphid-borne yellows virus)。測定該病毒的全長基因組序列5792nt并分析其基因組符合馬鈴薯卷葉病毒屬病毒基因組特性。通過多重比對,系統(tǒng)進化和重組分析明確該病毒由同屬的鷹嘴豆褪綠叢矮病毒(chickpea chlorotic stunt virus)與蕪菁黃化病毒(turnip yellow virus),蕓苔黃化病毒(brassica yellows virus)進化關(guān)系較近的未知病毒重組而來的新病毒。(4)明確了4種常見葫蘆科作物病毒的進化特征,發(fā)現(xiàn)了一些新類群�；贜GS測序數(shù)據(jù)獲得病毒的近似全長基因組序列用于4種主要病毒系統(tǒng)進化分析。來自本研究的黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus)全基因組序列遺傳多樣性不高都屬于ⅠB亞組,檢測到可能的重配現(xiàn)象;ZYMV的遺傳多樣性豐富,發(fā)現(xiàn)一個區(qū)別已報道所有ZYMV分離物的新組,提出ZYMV系統(tǒng)進化可能與地理位置相關(guān)性的假設(shè);基于西瓜花葉病毒(watermelon mosaic virus)全基因組序列系統(tǒng)進化關(guān)系重新規(guī)劃了病毒群體的系統(tǒng)進化關(guān)系;基于番木瓜花葉病毒(papaya ring spot virus)全基因組序列系統(tǒng)進化分析,定義1個PRSV新組,討論了PRSV系統(tǒng)進化與寄主和地理位置的相關(guān)性�；贜GS數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)方法對4種主要病毒基因組的SNP分析。本論文研究通過大量采集以西瓜甜瓜為主的葫蘆科病毒病害樣本,通過NGS,結(jié)合常規(guī)檢測方法,明確了中國葫蘆科作物病毒發(fā)生的種類與分布,建立了中國葫蘆科病毒組;鑒定了2種新發(fā)生病毒、1種病毒新種;分析了4種常見病毒的進化特征,發(fā)現(xiàn)了一些類群。這些研究結(jié)果,豐富了對中國乃至世界葫蘆科病毒發(fā)生與分布的認識,有利于病毒病害的防控。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S432.41
【部分圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆博士研究生學(xué)位論文以色列病毒學(xué)家對以色列相鄰的以色列東部兩個地區(qū)的 2016 年果實進行時間和空間病毒組對比分析，同時進行去除核糖體 RNA-s分析結(jié)果利用 VirusDetect 病毒流程工具進行分析。結(jié)果表明兩個地不同病毒構(gòu)成。如果不考慮時間，毛型病毒屬的 CYSDV 只發(fā)生在 區(qū)。而菜豆金色花葉病毒屬的西瓜褪綠矮化病毒（Watermelon chlo2018 年在以色列東部地區(qū)發(fā)生但是在 K 城沒有檢測到。也觀察到時黃病毒2017年在K城發(fā)現(xiàn)但是2016年沒有檢測到。最重要的是毛型在以色列是新入侵的病毒，在所有檢測樣本發(fā)現(xiàn)。病毒的豐度與煙有關(guān)（Luria et al, 2019）。1.6 技術(shù)路線與研究目的和意義

圖 2-1 中國葫蘆科作物檢測樣本田間采樣圖Fig 2-1 field-grown cucurbit samples in china圓圈顏色和大小表現(xiàn)該區(qū)域的樣本大小Color and size of the circles indicate the sampling size表 2-5 疑似病毒病樣品田間采樣信息表Table 2-5 The information of suspected virus-infected samples collected from fiel省份Province區(qū)縣Courty地塊Field樣本數(shù)量Sample number采樣時Collec湖南 Hunan 1 1 1 2017.云南 Yunan 1 1 1 2017.廣西 Guangxi 4 9 64 2017.海南 Hainan 4 4 31 2017.河南 Henan 6 9 48 2017.新疆 Xinjiang 6 9 44 2017.重慶 Chongqing 4 7 41 2018.四川 Sichuan 2 4 31 2018.江西 Jiangxi 3 8 27 2018.

圖 2-2 采集樣本的寄主分布Fig2-2 The host distribution in collected cuc采集的 288 份 疑似病毒病樣品，盡量根據(jù)采集地塊一致的原則，進行混樣測序，混樣信息見附錄Ⅳ�？偣矊y序，其中 sRNA-seq 106 份，rmRNA-seq 19 次份，測表 2-6 NGS 測序方法在不同采樣省Table 2-6 The distribution of NGS methods in differen省份 Province sRNA-seq rmRNA-seq廣西 Guangxi 22 0 海南 Hainan 6 6 河南 Henan 24 0 新疆 Xinjiang 5 13 重慶 Chongqing 19 0 江西 Jiangxi 13 0 四川 Sichuan 15 0 云南 Yunnan 1 0

【參考文獻】

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本文編號：2828734