植物內(nèi)生真菌資源豐富,次生代謝產(chǎn)物種類繁多,具有促生長、提高植物抗逆性、抑制病原菌、抗癌、降解環(huán)境污染物等功效。野大豆(Glycine soja)是大豆的近源種,是一種具有很強適應(yīng)能力和較強抗逆性的豆科植物。研究野大豆內(nèi)生真菌多樣性,探究其次生代謝產(chǎn)物的促生特性和發(fā)掘內(nèi)生真菌自身的抗重金屬特性,對豐富野大豆內(nèi)生真菌資源、探究內(nèi)生真菌與宿主之間的相互作用機制以及植物內(nèi)生真菌的資源利用和潛在價值具有重要意義。本研究采取組織塊法對野大豆內(nèi)生真菌進行分離,結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法對分離出的菌株進行鑒定;通過水培大豆植株的方法篩選具有良好促生長效果的菌株,通過過濾、超聲破碎、離心等方式獲得菌株胞內(nèi)胞外產(chǎn)物并比較兩者對水培大豆幼苗的促生效果;通過單因素實驗和正交實驗確定菌株的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件;通過菌絲干重法測定3種重金屬銅、鉛、鎘的不同濃度脅迫下,菌株對重金屬抗性;通過研磨、離心等方式提取重金屬脅迫下菌株的抗氧化酶,測定抗氧化酶活性變化。主要研究結(jié)果如下:1.野大豆內(nèi)生真菌分離鑒定。從新鮮的健康野大豆植株中分離獲得122株內(nèi)生真菌,其中包括葉37株,莖46株,根29株,種子10株。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定共分為9個屬,分別為鐮刀菌屬(Fusarium)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、角擔(dān)菌屬(Ceratobasidium sp)、枝頂孢屬(Acremonium)、青霉菌屬(Penicillium)、杯霉科(Discellaceae)、附球菌屬(Epicoccum)、鏈格孢屬(Alternaria Nees)和擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)。2.具有促生效應(yīng)菌株篩選。通過水培法對已分離的菌株進行篩選,其中菌株YD-25對大豆幼苗的促生效果最為明顯且為非病原菌,經(jīng)鑒定為黑附球菌(Epicoccum nigrum)。胞外產(chǎn)物可使培養(yǎng)4 d和6 d的大豆幼苗株高分別提高15.4%和18.1%。3.菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化。經(jīng)單因素及正交試驗表明,菌株YD-25的最適培養(yǎng)條件為:以馬鈴薯液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)可溶性淀粉4%、酵母浸粉0.5%、KH_2PO_40.15%、MgSO_4 0.05%,pH 3.0,培養(yǎng)8 d。4.菌株對三種重金屬抗性研究。YD-25菌株耐重金屬Cu~(2+)的性能良好,當(dāng)溶液中Cu~(2+)濃度達到2.5 mmol·L~(-1)時,菌體的耐性最好;當(dāng)溶液中Cu~(2+)濃度達到5mmol·L~(-1)時,菌絲仍可緩慢生長。隨著Cd~(2+)濃度逐漸增加,菌絲干重逐漸變小。當(dāng)Cd~(2+)濃度達到7.5 mmol·L~(-1)時,菌絲生長緩慢。菌株耐重金屬Pb~(2+)的性能良好,在鉛濃度為3 mmol·L~(-1)時,菌體的耐性最好;在Pb~(2+)濃度為10 mmol·L~(-1)時,菌絲仍可緩慢生長。5.重金屬脅迫下菌株抗氧化酶活性檢測。隨著Cd~(2+)濃度的增加,YD-25菌株的SOD活性隨之下降,CAT活性增加;YD-25菌株的SOD活性在Pb~(2+)濃度為1mmol·L~(-1)時最小,當(dāng)Pb~(2+)濃度達到3 mmol·L~(-1)時,YD-25菌株內(nèi)的CAT活性最高;YD-25菌株的SOD活性在Cu~(2+)為3 mmol·L~(-1)時最大,YD-25菌株的CAT活性在Cu~(2+)為2 mmol·L~(-1)時最大。
【學(xué)位單位】：沈陽師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1;Q93
【部分圖文】：

14圖 2-1 不同菌屬菌落形態(tài)Fig.2-1 Colony morphology of different genus2.3.2 野大豆內(nèi)生真菌分子鑒定經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定共分為 9 個屬，分別為鐮刀菌屬(Fusarium)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、角擔(dān)菌屬(Ceratobasidium sp)、枝頂孢屬(Acremonium)、青霉菌屬(Penicillium)、杯霉科(Discellaceae)、附球菌屬(Epicoccum)、鏈格孢屬

野大豆內(nèi)生真菌 YD-25 的篩選鑒定及促生、抗重金屬活性研究3.3 結(jié)果與分析3.3.1 12 株野大豆內(nèi)生真菌及發(fā)酵產(chǎn)物對大豆幼苗株高影響12 株野大豆內(nèi)生真菌及發(fā)酵產(chǎn)物對大豆幼苗株高影響見圖 3-1，其中 YD-16菌株的促生長效果最為明顯，但 YD-16 菌株為鏈格孢屬菌株，屬于病原菌，考慮到實際應(yīng)用會對農(nóng)作物造成病害，不予研究。最終選定促生效果僅次于 YD-16的 YD-25 菌株作為供試菌株。

圖 3-2 YD-25 菌株胞內(nèi)外產(chǎn)物對大豆幼苗生長影響Fig.3-2 Effects of intracellular and extracellular products of YD-25 strain on the growth ofsoybean seedlings3.4 結(jié)論與討論本章實驗選取從野大豆中分離出的 12 株內(nèi)生真菌(共 9 個屬)，通過破碎菌絲的方法菌絲及其次生代謝產(chǎn)物作用于大豆幼苗，篩選其中促生效果最好且自身為非病原菌的菌株 YD-25 作為供試菌株。通過超聲破碎、過濾離心等方法分別獲得菌株 YD-25 的胞內(nèi)胞外產(chǎn)物，通過水培法培育大豆幼苗并測量株高對菌株YD-25 的胞內(nèi)胞外產(chǎn)物的促生長活性進行評價，其中菌株 YD-25 胞外產(chǎn)物在第 4天和第 6 天的促生率分別達到了 15.4%和 18.1%，說明菌株 YD-25 的次生代謝產(chǎn)物對大豆幼苗具有一定的促生長作用。大多數(shù)植物內(nèi)生真菌及其自身代謝產(chǎn)物都可以直接或間接促進宿主植物生長。直接促進是植物內(nèi)生真菌自身可產(chǎn)生 IAA 或 ACC 脫氨酶等物質(zhì)，促進細(xì)胞伸長、刺激細(xì)胞加速分化，抑制植物體內(nèi)產(chǎn)生過量乙烯，從而達到促進宿主植物[89][90]

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本文編號：2823249