核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site,NBS)是一類抗病基因,在植物抗病反應(yīng)過程中起重要作用。目前,已在番茄、擬南芥、馬鈴薯等許多植物中發(fā)現(xiàn)了NBS基因,但關(guān)于草莓NBS基因功能方面的研究相對較少。本研究從八倍體栽培草莓‘艷麗’中克隆出FaNBS13基因編碼區(qū)序列,構(gòu)建了其過表達(dá)載體及沉默載體,獲得了轉(zhuǎn)基因草莓植株,通過接種灰霉病菌分析了其對草莓灰霉病菌的抗性,旨在為全面揭示草莓NBS13基因的功能奠定重要基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:(1)利用RT-PCR技術(shù)從八倍體栽培草莓‘艷麗’中克隆出FaNBS13基因,該基因編碼區(qū)序列全長為1776 bp,編碼592個氨基酸,利用DNAMAN 6.0軟件,對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)主要核心結(jié)構(gòu)域是LRR。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明FaNBS13蛋白主要定位在細(xì)胞核上。(2)利用qRT-PCR方法檢測了‘艷麗’草莓不同組織、器官中FaNBS13基因的相對表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)FaNBS13基因主要在葉片中表達(dá),以根為對照,老葉的表達(dá)量是根的2.3倍,隨著葉片衰老表達(dá)量增加;在萼片和雄蕊中的表達(dá)量相對較高,分別是1.2和1.9倍;隨著果實(shí)的成熟表達(dá)量也有顯著變化,但表達(dá)量較低。(3)利用pRI101-AN和pRI101-RNAi載體,分別構(gòu)建了FaNBS13基因的過表達(dá)載體及沉默載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將它們轉(zhuǎn)化到草莓中,最終得到過表達(dá)FaNBS13基因的轉(zhuǎn)基因草莓株系10個,沉默NBS13基因的轉(zhuǎn)基因草莓株系6個。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將菌液注射到‘艷麗’草莓果實(shí)中,待果實(shí)成熟后接種灰霉病菌,通過觀察發(fā)病情況和基因表達(dá)量驗(yàn)證分析表明FaNBS13基因能夠提高草莓果實(shí)的灰霉病抗性。(4)分別用IAA、SA、MeJA、ABA四種激素對‘Ruegen’草莓組培苗進(jìn)行處理,分別在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h取樣,利用qRT-PCR方法檢測NBS13基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在四種激素處理下NBS13的表達(dá)量均上調(diào),且在IAA處理下的表達(dá)量相對較高。(5)選取生長狀態(tài)基本一致的日本草莓品種‘幸香’和‘櫪乙女’、歐美草莓品種‘甜查理’和‘圖德拉’及自育草莓新品種‘艷麗’葉片,通過接種灰霉病菌后檢測NBS13基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),與未接種的葉片相比,NBS13基因的表達(dá)量均上調(diào),且在感病后的日本品種中NBS13基因表達(dá)量的增加比歐美品種多。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S668.4;Q943.2
【部分圖文】：

結(jié)果與分析3 結(jié)果與分析克隆與結(jié)構(gòu)分析隆 RNA 質(zhì)量分析艷麗’草莓葉片中的總 RNA，rRNA 和 18S rRNA 的條帶非常較低。將提好的 RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)cDNA 的質(zhì)量，通過瓊脂糖凝膠好（圖 2）。

S驗(yàn)證圖

圖 4 菌落 PCR 電泳檢測M：DL5000 DNAMarker；4、10、14：FaNBS13Fig.4 The electrophoretogram of PCR amplificationM: DL5000 DNAMarker; 4, 10, 14: FaNBS13

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本文編號：2823208