哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育是指卵母細(xì)胞受精并發(fā)育到囊胚的整個(gè)過程,在此期間發(fā)生數(shù)個(gè)標(biāo)志性關(guān)鍵事件,如母源因子降解、合子基因激活、卵裂球致密化、桑囊轉(zhuǎn)換等。胚胎早期發(fā)育機(jī)制的深度解析對輔助生殖的發(fā)展具有至關(guān)重要的推進(jìn)作用。大多數(shù)體外成熟的卵母細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上是正常的,但在受精之后出現(xiàn)發(fā)育缺陷,其中母源因子降解異常就是原因之一。母源因子是指在卵母細(xì)胞發(fā)生過程中在細(xì)胞質(zhì)中合成并儲(chǔ)存的RNA和蛋白質(zhì)等,對于調(diào)控早期胚胎發(fā)育是必需的,隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行,其功能逐漸被合子基因組的產(chǎn)物所取代,母源因子逐漸發(fā)生降解。母源因子降解主要體現(xiàn)為母源mRNA的降解,其主要通過母源通路和合子通路相互配合實(shí)現(xiàn)。前期的研究揭示了RNA結(jié)合蛋白、microRNA(miRNA)和piwi-interacting RNA(piRNA)在母源mRNA降解過程中的功能機(jī)制,而近年來越來越受關(guān)注的內(nèi)源性小干擾RNA(endo-siRNA)在此事件中的功能一直沒有被深入研究。Endo-siRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)具有重要的負(fù)調(diào)控作用,預(yù)示著其在母源mRNA降解過程中可能具有重要功能。據(jù)此,本研究對endo-siRNA在小鼠早期胚胎中母源mRNA降解中的功能進(jìn)行探究。本研究首先通過生物信息學(xué)對母源基因及對應(yīng)小RNA進(jìn)行篩選與鑒定,共鑒定出2730個(gè)母源基因及對應(yīng)的9148條endo-siRNAs和72條miRNAs。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),endo-siRNAs主要在二細(xì)胞期前高水平表達(dá),在四細(xì)胞期顯著下調(diào),而miRNA則是在二細(xì)胞階段才出現(xiàn)表達(dá)量上調(diào),而此時(shí)大部分母源mRNA已經(jīng)完成降解,而endo-siRNA主要存在于卵母細(xì)胞、一細(xì)胞和二細(xì)胞期胚胎中,其表達(dá)模式與母源mRNA表達(dá)模式存在負(fù)相關(guān),預(yù)示著endo-siRNA在小鼠母源mRNA降解中可能具有關(guān)鍵作用。Endo-siRNA的形成主要依賴Dicer,實(shí)驗(yàn)通過在合子期注射Dicer干擾片段和抗體,對其mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行敲低,檢測endo-siRNA的缺失對母源mRNA降解的影響。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,Dicer敲低導(dǎo)致1164個(gè)基因表達(dá)水平出現(xiàn)異常,其中上調(diào)基因462個(gè),其中母源基因只有71個(gè),暗示endo-siRNA在合子通路中功能有限,可能主要通過母源通路發(fā)揮功能。隨后通過RT-PCR和qPCR對篩選的母源基因Spin、Zfp277和Brip及其對應(yīng)endo-siRNAs的表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示母源mRNA的表達(dá)模式確實(shí)和endo-siRNA存在負(fù)相關(guān),進(jìn)一步通過注射endo-siRNAs的模擬物和阻遏物,明確endo-siRNA在母源mRNA降解過程中發(fā)揮著重要功能,并且通過mRNA降解實(shí)驗(yàn),證明endo-siRNA在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)母源mRNA的降解。本研究對endo-siRNA的形成機(jī)制進(jìn)行解析,通過序列比對發(fā)現(xiàn)一條lncRNA(lnc521),在endo-siRNA形成的區(qū)域與母源基因Zfp277形成互補(bǔ)。Lnc521特異性地在一細(xì)胞期高表達(dá),并在細(xì)胞質(zhì)中特異性表達(dá)。通過RNA干擾技術(shù),發(fā)現(xiàn)lnc521敲低顯著影響了Zfp277相應(yīng)endo-siRNA的形成,并且通過顯微注射322bp的lnc521序列,可以有效地補(bǔ)償endo-siRNA的形成,并且恢復(fù)了母源基因Zfp277的降解,這表明母源基因Zfp277對應(yīng)的endo-siRNA形成是lnc521依賴性的。在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過程中,母源因子向合子轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)換具有重要意義,在這個(gè)過程中母源因子迅速發(fā)生降解,被胚胎產(chǎn)生的新物質(zhì)替代。本研究結(jié)果表明,endo-siRNA在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)母源mRNA降解,為母胚轉(zhuǎn)換機(jī)制研究開啟新的方向。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q344
【部分圖文】：

第一次卵裂時(shí)，非哺乳類動(dòng)物已經(jīng)完成原腸胚形成，因此哺乳動(dòng)物著床前發(fā)育過程被認(rèn)為是胎盤動(dòng)物為了適應(yīng)在陸地上生存的進(jìn)化特征。圖1-1 小鼠早期胚胎發(fā)育[2]。Fig. 1-1 Early mouse embryo development[2].在早期胚胎中，調(diào)控發(fā)育過程的職能在母源因子和胚胎基因組之間的轉(zhuǎn)換，定義為合子基因轉(zhuǎn)換（MZT），小鼠受精卵主要合子基因組激活發(fā)生在二細(xì)胞期，并且引發(fā)了基因表達(dá)水平顯著變化，此過程作為合子基因組自身調(diào)控發(fā)育過程標(biāo)志性事件（圖 1-2）。此階段的轉(zhuǎn)換過程表現(xiàn)出胚胎發(fā)育各時(shí)期轉(zhuǎn)錄組相似性，通過微陣列分析以及 NGS 轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)一細(xì)胞期胚胎與二細(xì)胞期胚胎轉(zhuǎn)錄組存在明顯差異，而二細(xì)胞期轉(zhuǎn)錄組與著床前發(fā)育后期胚胎相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了小鼠基因組激活的時(shí)期[3]。需要說明的是，在晚期小鼠一細(xì)胞胚胎發(fā)生次要基因組激活

合成提供了豐富的原始物質(zhì)。在小鼠中，卵母細(xì)胞從 GV 期到晚期一細(xì)胞胚胎過程中的轉(zhuǎn)錄是沉默的，在減數(shù)分裂恢復(fù)之后母源因子開始降解，近 90%的母源 mRNA 在二細(xì)胞期時(shí)已被圖1-3 母源因子降解的時(shí)空調(diào)控[32]。Fig. 1-3 Temporal control of maternal factor clearance[32].降解，并且已有多項(xiàng)研究顯示，母源因子降解過程的異常會(huì)影響整個(gè)胚胎發(fā)育進(jìn)程，如合子基因組激活，因此母源因子的降解在時(shí)間和空間上受到嚴(yán)格調(diào)控，正常的降解對于胚胎發(fā)育是十分重要的。1.1.4 母源因子降解與腺苷酸化卵母細(xì)胞和早期胚胎是轉(zhuǎn)錄沉默的，因此早期發(fā)育過程完全依賴于母源因子，母源因子的早期調(diào)控過程是在細(xì)胞質(zhì)中完成的，涉及 mRNA 穩(wěn)定性、翻譯以及 RNA 定位，并且三個(gè)方面高度相關(guān)。信使 RNA 在 5’端具有帽子結(jié)構(gòu)，在 3’端具有 poly（A）尾，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)對于 mRNA 的翻譯和穩(wěn)定性十分重要[33, 34]。其中 mRNA poly（A）長度的調(diào)控對翻譯過程至關(guān)重要

圖1-4 SMG在母源因子降解中的調(diào)控機(jī)制[32]。Fig. 1-4 Regulation mechanism of SMG in maternal factor clearance[32].子基因轉(zhuǎn)換過程中母源 mRNA 降解的重要組件，約有三分之二的 mRNA 受到 SMG 的調(diào)控[71在 mRNA 降解過程中與 SMG 直接作用的 RNA 有著共同的特點(diǎn)，在其序列中都富含 SRESMG 的合成取決于受精卵激活誘導(dǎo)的級聯(lián)放大反應(yīng)，在受精后不久呈現(xiàn)瞬時(shí)的峰值，SM的時(shí)序調(diào)控對于受精卵激活之后 mRNA的降解同樣起關(guān)鍵作用。除CCR4-NOT復(fù)合體和SM之外，piRNA 也同樣是 mRNA 降解的母源機(jī)制中的一部分，在果蠅中，大部分 piRNA 是轉(zhuǎn)座元件產(chǎn)生的，piRNA 的主要功能是通過類似于 RNA 干擾機(jī)制抑制轉(zhuǎn)座元件的表達(dá)和殖系轉(zhuǎn)移。PiRNA 通常與 Argonaute 蛋白結(jié)合靶向 mRNA，其在特異性 mRNA 降解上具有要的功能，在卵母細(xì)胞成熟過程中同樣合成并儲(chǔ)存了大量 piRNA，有研究表明 piRNA 可以向 Nos mRNA 3’UTR，與 AUB、AGO3、SMG 和 CCR4 形成復(fù)合體，引發(fā) Nos mRNA 的脫苷酸化和降解[72-74]，Nos 依賴于 piRNA 的降解通路對于胚胎前后軸的建立是必需的[75]。MIW參與了非轉(zhuǎn)座元件 RNA 的調(diào)控，MIWI 可以獨(dú)立與 mRNA 結(jié)合，它們的相互作用使 mRN處于翻譯抑制狀態(tài)[76]。在非洲爪蟾中，母源 mRNA 的降解只發(fā)生在 MZT 之后[77-79]。脫腺酸化由胚胎脫腺苷酸元件（EDEN）驅(qū)動(dòng)，由位于 3’UTR 中富含的 GU 序列組成，可與 EDEN-B結(jié)合，與 EDEN-BP 結(jié)合的很多 mRNA 參與卵母細(xì)胞成熟[80]，在早期胚胎中脫腺苷酸化的序調(diào)控取決于受精時(shí) EDEN-BP 的激活（圖 1-5）。

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本文編號：2823340