發(fā)布時間：2020-09-18 21:48

　　 槐糖脂是利用微生物代謝合成的一種表面活性劑,它不僅具有日常表面活性劑所具有的增溶、乳化、潤濕、發(fā)泡、分散、降低表面張力等通用性能,而且對環(huán)境的耐受性也是極強。熊蜂生假絲酵母(Starmerella bombicola)能夠發(fā)酵生產槐糖脂,但槐糖脂具有酸型、內酯型和乙�；偷炔煌愋�,結構多樣。本文擬通過代謝工程改造,構建高產單一的酸型槐糖脂的熊蜂生假絲酵母工程菌株。論文主要結果如下:(1)利用生物信息學工具,從熊蜂生假絲酵母基因組中分離出了1條可能的過氧化物酶體合成影響因子PEX10并且鑒定其功能。構建了PEX10基因缺失菌株,該基因的缺失對十二烷和葡萄糖的代謝沒有影響,但嚴重阻礙了細胞對菜籽油的利用使得槐糖脂的產量也大幅度下降。(2)通過基因敲除和基因過表達的基因工程手段,構建了SBLE基因缺失菌株和SBLE過表達菌株評價該基因功能。通過熒光定量PCR(qPCR)檢測了各菌株的SBLE基因轉錄水平,SBLE過表達菌株的SBLE的轉錄量是野生型菌株的30多倍,SBLE基因缺失菌株沒有檢測到;發(fā)酵結果顯示,SBLE基因缺失菌株的發(fā)酵產物中只檢測到了酸型槐糖脂,SBLE過表達菌株的發(fā)酵產物主要是內酯型槐糖脂,沒有檢測到酸型槐糖脂。(3)通過合理的設計,構建了潮霉素基因重復利用系統(tǒng)。在熊蜂生假絲酵母S.bombicola半乳糖誘導型啟動子控制下,結合β-Rec絲氨酸重組酶,構建了潮霉素抗性篩選標記自彈出系統(tǒng),該系統(tǒng)主要包括潮霉素抗性基因表達盒、β-Rec絲氨酸重組酶和兩個SIX重組位點。該系統(tǒng)的構建實現了潮霉素抗性基因的自我彈出及潮霉素標記的多次使用,從而可以對熊蜂生假絲酵母進行多基因的改造。(4)在潮霉素抗性標記基因重復利用系統(tǒng)Rec-six基因編輯系統(tǒng)基礎上構建了幾株高產酸型槐糖脂的重組菌。通過將合成內酯型槐糖脂的關鍵基因—內酯酶基因SBLE敲除獲得一株只產酸型槐糖脂的工程菌株SBSL1(Δsble::six),進一步同源過量表達葡萄糖基轉移酶基因UGTB并敲除過氧化物酶體膜轉運蛋白編碼基因PXA1,構建了高產酸型槐糖脂的酵母工程菌。與出發(fā)菌株相比,重組熊蜂生假絲酵母發(fā)酵油酸能夠合成單一的酸型槐糖脂,而不再合成內酯型槐糖脂,同時酸型槐糖脂的產量由20 g·L~(-1)提高到44g·L~(-1)。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;Q93

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本文編號：2822225