光電融合成像技術(shù)(Correlative Light and Electron Microscopy,CLEM)已成為生命科學領(lǐng)域一個強有力的研究工具,尤其是冷凍光電融合成像技術(shù)(Cryo-CLEM),被認為是一種接近生物樣品天然狀態(tài)的成像技術(shù)。冷凍樣品制備方法能避免化學固定方法對樣品結(jié)構(gòu)的破壞,使樣品處于近天然狀態(tài),保留近原子尺度的結(jié)構(gòu)信息;冷凍熒光成像技術(shù)(Fluorescence Cryo-Microscopy,Cryo-FM)可對特異性標記的目標生物大分子或結(jié)構(gòu)進行納米尺度的識別和定位,但分辨率暫且還未達到解析其超微結(jié)構(gòu)的層次;冷凍電鏡技術(shù)(Cryo-Electron Microscopy,Cryo-EM)具有超高分辨率,可對生物大分子或結(jié)構(gòu)進行近原子分辨率的結(jié)構(gòu)解析,但缺乏高效精確識別、定位特定目標生物大分子或結(jié)構(gòu)的能力。冷凍光電融合成像技術(shù)將冷凍樣品制備、冷凍熒光成像和冷凍電鏡這三種技術(shù)結(jié)合并實現(xiàn)優(yōu)勢互補,使研究者可以在細胞原位對目標生物大分子或結(jié)構(gòu)同時實現(xiàn)高精度的定位分析和高分辨的結(jié)構(gòu)解析。冷凍光電融合成像技術(shù)方興未艾,還存在很多技術(shù)上的不足。本論文將從冷凍光鏡平臺和樣品支撐膜兩個方面入手,進一步完善冷凍光電融合成像技術(shù)。本論文第一部分主要介紹超穩(wěn)冷凍超分辨熒光顯微成像系統(tǒng)的設計和構(gòu)建,并通過對冷凍含水切片和完整細胞樣品的光敏定位顯微成像(Photoactivated Localization Microscopy,PALM)驗證系統(tǒng)的超分辨成像能力。與原有的冷凍熒光顯微成像系統(tǒng)相比,該系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢:1)超高的溫度穩(wěn)定性:系統(tǒng)溫度平衡后,物鏡和樣品10個小時內(nèi)的溫度波動均小于0.06 K(半小時內(nèi)的溫度波動小于0.02 K);2)極高的機械穩(wěn)定性:在93 K溫度情況下,熒光珠樣品在5個小時內(nèi)的X、Y、Z三軸機械漂移均小于200 nm;3)所設計的換樣裝置和流程可確保在135 K溫度以下高效安全裝載、轉(zhuǎn)移和回收冷凍含水樣品;4)具備超分辨成像能力(本次工作冷凍含水切片和完整細胞樣品的單分子平均定位誤差分別是13.0 nm和13.6 nm)。本論文第二部分主要介紹冷凍光電融合成像支撐膜的探索研究。我們利用氧化銦錫(Indium Tin Oxide,ITO)改善方華膜(Formvar film)的導電性能,開發(fā)了新型的Formvar-ITO支撐膜,并利用新型支撐膜承載冷凍含水切片進行超分辨冷凍光電融合成像,實驗結(jié)果證實該支撐膜可以滿足冷凍光電融合成像的需求。此外,我們還利用構(gòu)建的成像系統(tǒng)和發(fā)展的樣品支撐膜參與了p62陽性蛋白聚集體結(jié)構(gòu)的研究,通過冷凍光電融合成像,我們發(fā)現(xiàn)該聚集體是一種特殊的多層膜結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)的獲得為其功能的進一步研究提供了證據(jù)。和原有的樣品支撐膜相比,新型支撐膜具有以下優(yōu)勢:1)激光吸收遠遠小于10 nm碳膜,常用激光波段(405 nm、488 nm、561 nm、647 nm),10 nm ITO薄膜的光吸收約為10 nm碳膜的44.4%、16.8%、14.9%、16.1%;2)承載冷凍含水切片時可承受約2.0 kW/cm~2的488 nm激光照射,能夠滿足Cryo-PALM成像的需求;3)冷凍電鏡下Formvar-ITO支撐膜的性能優(yōu)于Formvar-Carbon支撐膜,適合冷凍電鏡成像。本論文所涉及的兩部分內(nèi)容既相互獨立又具有內(nèi)部緊密聯(lián)系。超穩(wěn)冷凍超分辨熒光顯微成像系統(tǒng)優(yōu)異的溫度和機械穩(wěn)定性以及新型樣品支撐膜良好的透光性和導電性,共同為實現(xiàn)玻璃態(tài)生物樣品的Cryo-PALM成像提供了必要的技術(shù)支撐。同時,二者對現(xiàn)有冷凍光鏡平臺和樣品支撐膜方面的優(yōu)化改進,又都為進一步完善冷凍光電融合成像技術(shù)提供了新方案。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q6-33
【部分圖文】：

圖 1.1 胡克的復式顯微鏡和現(xiàn)代顯微鏡（圖片來源 olympus-lifescience.com.cn）Figure 1.1 Hooke microscope and Modern microscope與顯微鏡的其它部分相比，樣品照明方式的發(fā)展就慢得多。最開始使用的照明方式是臨界照明，其存在照明不均勻和容易損壞樣品等缺點。1893 年，德國工程師柯勒發(fā)明了柯勒照明技術(shù)，這項技術(shù)克服了臨界照明的缺點，為顯微鏡提供了均勻的照明方式。細胞樣品通常是透明的，一般需要染色后才能看清內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，1935年，荷蘭科學家澤尼克發(fā)明相差顯微鏡（Phase Contrast Microscope）[1]，使得顯微鏡可以觀察未經(jīng)染色的細胞，他也因此獲得了1953年的諾貝爾物理學獎。在其基礎上，1952 年波蘭科學家諾馬斯基發(fā)明了微分干涉相差顯微鏡（Differential InterferenceContrast Microscope）[2]，與相差顯微鏡相比，其主要優(yōu)點是增強了樣品圖像的三維立體感，樣品也可略厚一些。顯微鏡技術(shù)的進步和生命科學的發(fā)展是相輔相成的，顯微鏡的發(fā)展使得人們對

成像技術(shù)不同，它是利用熒光基團對目標蛋白或分子進行特異內(nèi)部形成熒光光源，成像時利用較高功率的光源照射樣品激發(fā)，熒光信號被物鏡收集，后經(jīng)成像系統(tǒng)或投射入眼睛觀察或通。顯微鏡結(jié)構(gòu)與普通的光學顯微鏡略有不同，需要加入熒光激發(fā)光等），二向色分光鏡（Dichroic Mirror, DM）及濾光片（Emissi Filter）等組件。熒光激發(fā)光源激發(fā)樣品中的熒光基團發(fā)出熒光光分開，濾光片用來篩選激發(fā)光和熒光的波長，典型的落射式 1.2（B）所示。熒光顯微鏡成像技術(shù)的出現(xiàn)使得研究細胞內(nèi)特胞結(jié)構(gòu)成為可能，如細胞膜，細胞骨架，線粒體，高爾基體，。除此之外，利用熒光顯微成像技術(shù)的高特異性和較高的時空細胞活動的某些動態(tài)過程，如胞吞，胞吐，細胞內(nèi)物質(zhì)運輸，裂凋亡等過程。熒光顯微成像技術(shù)已成為現(xiàn)代生物學研究必不可

如圖1.3（B）所示。其定義是一個點光源愛里斑光強度的主極大值正好位于另一個愛里斑光強度的第一極小值的位置，此時這個距離就是瑞利分辨率，這個分辨率與光學系統(tǒng)的放大倍數(shù)無關(guān)。在單色光源的系統(tǒng)中，瑞利分辨率由以下公式描述：rxy=0.61λNA（1.3）rz=λnNA2（1.4）由公式（1.3）和（1.4）可以看出，理論上可以通過提高 NA 的值和降低λ的值來提高光學系統(tǒng)的分辨率。但是在實際中，成像所用光源通常在可見光波段（λ：400nm~700 nm）；受介質(zhì)折射率和物鏡制作工藝的限制，NA 也很難提高（NA 值最高物鏡的 NA 值約為 1.7）。這些客觀存在限定了傳統(tǒng)光學系統(tǒng)的側(cè)向分辨率極限約為 200

【相似文獻】

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1 楊東生;細胞電融合的研究進展[J];重慶醫(yī)藥;1989年02期

2 吳逸;鄭強;;大花萱草原生質(zhì)體分離和電融合(封四說明)[J];植物雜志;1989年02期

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本文編號：2822427