發(fā)布時間：2020-09-10 20:53

　　 當(dāng)前,石油等不可再生能源日益匱乏,化石燃料燃燒所帶來的環(huán)境問題也日益嚴(yán)重,開發(fā)清潔的可再生能源已成為當(dāng)下最緊迫的任務(wù)之一。木質(zhì)纖維素的儲存量十分龐大,而且價格低廉。將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為液體燃料纖維素乙醇,既可以有效地緩解能源危機(jī),又能保護(hù)生態(tài)環(huán)境,還能使?jié)撛诘馁Y源被充分挖掘利用。在這一生物煉制過程中,纖維素酶的作用尤為突出。纖維素酶是高度糖基化的,通過改造纖維素酶的糖基化修飾來提高酶的活性,進(jìn)而提高纖維素的水解效率是一個新的突破口。而如果想對纖維素酶的糖基化進(jìn)行改造,需要首先對纖維素酶糖基化的位點(diǎn)和糖鏈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)的了解。本文以纖維素酶高產(chǎn)菌株Trichodermareesei RutC-30和纖維素酶低產(chǎn)菌株Trichodermareesei QM9414為研究對象,系統(tǒng)的研究了里氏木霉纖維二糖水解酶I(以下簡稱TrCBHI)在乳糖、纖維二糖和豐富培養(yǎng)基誘導(dǎo)下的糖基化修飾情況。將六種目的蛋白分離純化,然后通過混合酶解(gluC+trypsin和chymotrypsin)的方法分別處理目的蛋白,將獲得的肽段用ZIC-HILIC色譜柱進(jìn)行分離,收集糖肽后分別采用碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)和電子轉(zhuǎn)移裂解(ETD)這兩種破碎方式使糖肽解離,最后用LC-MS/MS進(jìn)行分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示(1)發(fā)現(xiàn)N64上有高甘露糖型的N-糖鏈修飾。在T.reesei RutC-30和T.reesei QM9414的TrCBH I中均鑒定到了N64上有糖基化修飾,且糖鏈形式為高甘露糖型。(2)N45上除了有雜合型的糖鏈,還有高甘露糖型的糖鏈修飾。(3)TrCBH I的CD區(qū)普遍存在O-糖基化修飾。以前對TrCBH I的CD區(qū)的O-糖基化的研究很少,只有近期的一篇文獻(xiàn)中報道其S20、S21和T24上各有一個HexNAc修飾。而在本研究中,鑒定出11個新的O-糖基化位點(diǎn),如S8、T10、T232、S396等。在這些O-糖基化位點(diǎn)上,通常有1～4個Hex或者1～2個HexNAc修飾。(4)TrCBH I的CBM區(qū)有新的O-糖基化位點(diǎn)T484。以前只有一篇文獻(xiàn)報道CBM的Thr462和Ser464上有1～3個Man修飾。本研究中,將T.reesei RutC-30在乳糖誘導(dǎo)下,發(fā)現(xiàn)其TrCBH I中484位置上的蘇氨酸上有單個的Hex修飾。(5)TrCBH I的CD區(qū)的糖基化位點(diǎn)趨于形成糖基化簇。在TrCBH I的CD區(qū),發(fā)現(xiàn)5個糖基化簇,它們分別是N270/T271/S272/S396,T232/T255,T383/N384/T389,S8/T10 和 N45/S46。其中,N45/S46和S8/T10位于催化活性位點(diǎn)隧道入口附近,而T383/N384/T389位于與纖維素晶體最接近的肽環(huán)上,從而暗示了這三個糖基化簇可能與底物識別或者對底物的催化活性有關(guān)。通過橫向分析來看,不同菌株在同一碳源誘導(dǎo)下TrCBH I的糖基化修飾情況不同,不僅如此,同一菌株在不同碳源誘導(dǎo)下TrCBH I的糖基化修飾情況也不同。從菌株上來看,與T.reesei QM9414相比,纖維素酶高產(chǎn)菌株T.reesei RutC-30的糖基化更為多樣化和復(fù)雜化,且同一位點(diǎn)上糖鏈的異質(zhì)性較嚴(yán)重。而從誘導(dǎo)方式上來看,乳糖誘導(dǎo)下的TrCBH I的糖基化位點(diǎn)更豐富,糖鏈的形式更為多樣。通過對纖維素酶高產(chǎn)菌株T.reese/RutC-30和纖維素酶低產(chǎn)菌株T.reesei QM9414在不同碳源誘導(dǎo)下的糖基化進(jìn)行系統(tǒng)的研究,深入挖掘出更多糖基化修飾的位點(diǎn)和糖鏈,使人們對TrCBH I的糖基化了解的更全面,為后續(xù)對糖基化進(jìn)行改造進(jìn)而提高纖維素酶的水解活性奠定了堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：X705;Q936
【部分圖文】：

２．邋３．１六種粗酶液中蛋白的定性檢測逡逑為了定性的了解粗酶液中蛋白成分的含量，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳進(jìn)行檢測，逡逑這六種粗酶液的膠圖如圖２．１所示：逡逑Ａ邐ｍ邐Ｂ邋Ｍ逡逑—８０邐２0邐沙逡逑ＪｊＭｋ邐ｌ00逡逑一一逡逑ｓ0邐—邋＾邋ｒ；邋ｍｍ逡逑Ｉ邋—邐４0邐５。？＊邐

本文編號：2816315